시료 수집과 관련된 모든 절차는 기관의 IRB 가이드라인에 따라 수행되었습니다.
1. 센다이 바이러스(Sendai Virus)를 이용한 형질도입
- 형질도입 (0일차)
- 혈구 세포를 수집하여 15ml 코니컬 튜브로 옮긴 후, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정한다.
- 3 x 10^5개의 세포를 준비하고5 전달당 세포 수를 준비하고, 상온(RT)에서 515 x g로 5분간 세포를 원심분리한다.
- 흡입법으로 상층액을 제거하고 0.5 ml의 혈구 배지에 세포를 재현탁한다.
- 세포를 코팅되지 않은 24-웰 플레이트의 웰에 옮깁니다.
- Sendai virus 혼합물을 얼음 위에서 해동하여 부유 세포에 첨가한다. 제조사의 권장 사항에 따라 세포에 Sendai virus를 첨가한다.
- 플레이트를 실링 필름으로 밀봉하고 30 °C에서 1,150 x g로 30분간 원심분리한다. 30 °C.
- 원심분리 후, 세포를 다음 조건에서 배양한다. 37 °C 5% CO2에서2 하룻밤 동안(O/N).
- 피더 매트릭스로의 세포 전이 (1일 차)
- 다음 날, 24-웰 플레이트를 vitronectin으로 코팅한다. vitronectin 용액을 PBS로 희석하여 최종 5 µg/ml 농도. 24-웰 플레이트의 웰에 vitronectin 1ml를 넣고 실온(RT)에서 최소 1시간 동안 배양한다. 사용 전 코팅 용액을 제거한다. 코팅된 플레이트는 실온에서 3일 동안 보관할 수 있다.
- 세포와 바이러스가 포함된 모든 배지를 코팅된 웰로 옮긴다.
- 신선한 혈구 배지 0.5ml를 추가로 사용하여 남은 세포를 수집한 후, 세포가 들어 있는 웰에 첨가한다.
- 플레이트를 1,150 x g에서 10분 동안 원심분리하십시오. 35 °C.
- 원심분리 후 상층액을 제거하고 iPSC 배지 1ml를 첨가한 뒤, 세포를 다음 조건에서 유지한다. 37 °C 5% CO2에서2 하룻밤 동안 (O/N)
- 2차 세포 이식 (2일 차)
- 새로운 24-웰 플레이트의 웰을 다음으로 코팅한다. 5 µg/ml 단계 1.2.1에서 설명한 대로 vitronectin으로 코팅한다. 각 형질전환당 플레이트의 웰 하나를 사용한다.
- 첫 번째 플레이트의 세포 현탁액을 새로 코팅한 비트로넥틴(vitronectin) 플레이트로 옮깁니다.
참고: 필요하지 않은 경우, 부유 세포는 폐기할 수 있습니다. 단계 2.3에 언급된 절차를 부유 세포를 대상으로 2~3회 반복할 수 있습니다. 해당 단계들을 반복하는 경우, 세포를 회수하십시오. - 그동안 유지 관리를 위해 첫 번째 플레이트의 웰에 1 ml의 iPSC(유도만능줄기세포) 배지를 첨가하고, 다음 조건에서 배양한다. 37 °C 5% CO2에서2 하룻밤 동안(O/N)
- 부착된 세포를 다음 조건에서 유지하십시오. 37 °C 및 5% $\text{CO}_2$2 신선한 iPSC 배지로 매일 배지를 교체한다. 콜로니는 형질전환 후 14~21일 사이에 나타난다.
- 부유 세포가 포함된 새로 코팅된 플레이트를 1,150 x g에서 원심분리하고 35 °C 10분 동안.
- 원심분리 후, 세포를 다음 조건에서 배양한다. 37 °C 5% CO2에서2 하룻밤 동안(O/N).
- 다음 날, 상층액을 제거하고 신선한 iPSC 배지로 교체한다.
참고: 단계 1.3에 언급된 절차는 부유 세포를 사용하여 2-3회 반복할 수 있습니다. 해당 단계를 반복하려면 상청액의 세포를 회수하여 단계 1.3을 다시 수행하십시오. - 부착된 세포는 80% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하며 유지한다.
