스트렙타비딘 블로킹 분석법을 이용한 인플루엔자 바이러스 내입 분석

초록

Pohl, M. O. & Stertz, S. 유세포 분석법을 이용한 A549 세포 내 인플루엔자 A 바이러스의 부착 및 내입 측정. J. Vis. Exp. (2015) 본 영상은 인간 폐 상피 세포에서 표면에 결합된 인플루엔자 바이러스와 내입된 바이러스를 구분하기 위한 스트렙타비딘 블로킹 분석법의 활용 방법을 보여줍니다. 형광 신호를 비교함으로써, 배양 후 신호 강도가 높을수록 바이러스 내입이 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다. Pohl, M. O. & Stertz, S. 유세포 분석법을 이용한 A549 세포 내 인플루엔자 A 바이러스의 부착 및 내부화 측정. J. Vis. Exp. (2015)

본 영상에서는 스트렙타비딘 차단 분석법(streptavidin blocking assay)을 사용하여 인간 폐 상피 세포에서 세포 표면에 결합된 인플루엔자 바이러스와 내부로 유입된 바이러스를 구분하는 방법을 보여줍니다. 형광 신호를 비교하여 배양 후 강도가 더 높게 나타나면 바이러스의 내부 유입이 성공적으로 이루어졌음을 의미합니다.

프로토콜

1. 부착/내입 분석

참고: 분석을 시작하기 전에 모든 시약을 준비하십시오. 결과 섹션에 제시된 세 가지 대조군(모의 감염 세포, 뉴라미니다제 전처리 세포 및 아지드화 나트륨 처리 세포)의 경우, 프로토콜의 일부 수정이 필요합니다.

1. A549 세포 20,0개가 포함된 딥웰 튜브 16개를 준비한다. 4개의 튜브로 구성된 실험군 외에, 각각 4개의 튜브가 필요한 3가지 대조군 조건(모의 감염 세포, neuraminidase (NA) 전처리 세포, sodium azide 처리 세포)을 설정한다. 각 그룹은 ‘0 min’, ‘0 min + streptavidin (STV)’, ‘30 min’, ‘30 min + STV’로 라벨링된 4개의 튜브로 구성된다.
2. 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 20 µl phosphate-buffered saline (PBS)에 재현탁한다.
3. 4 °C에서 450 x g로 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 0.3% bovine serum albumin (BSA), 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 및 1% penicillin-streptomycin이 포함된 20 µl Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)(배양 배지)에 재현탁한다. 37 °C에서 30분 동안 배양한다.
   참고: neuraminidase 대조군의 경우: 배양 배지에 희석하여 200 mU/ml 농도의 박테리아 neuraminidase(예: Vibrio cholera 유래 sialidase)를 사용하여 세포를 재현탁한다.
4. 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 20 µl PBS에 재현탁한다. 이 단계를 한 번 더 반복한 후, 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 냉각시킨다.
5. 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 10 µl biotinylated virus(infection-PBS에 희석하여 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용)에 재현탁한다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양한다.
6. 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 20 µl PBS에 재현탁한다. 이 단계를 한 번 더 반복한다.
   참고: 모의 감염 대조군의 경우: 바이러스가 없는 infection-PBS를 사용한다. sodium azide 대조군의 경우: 0.1 % sodium azide가 첨가된 infection-PBS에 희석된 바이러스를 사용한다.
7. 얼음 위에서 감염시킨 후 샘플 처리:
   1. ‘0 min’ 샘플의 경우, 단계 2.5를 따르고 다른 샘플들이 고정될 때까지 4 °C에서 보관한다.
   2. ‘0 min + STV’ 샘플의 경우, 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 2% BSA와 0.1% sodium azide가 포함된 PBS(샘플 취급 중 내부화를 방지하기 위함)에 희석된 50 µl STV(섹션 3에서 결정된 농도 사용)에 재현탁한다. 얼음 위에서 30분 동안 배양한다.
   3. 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 20 µl PBS에 재현탁한다. 이 단계를 한 번 더 반복한다.
   4. 고정을 위해 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 10 µl의 3.7% paraformaldehyde (PFA)에 재현탁한다. 상온(RT)에서 10분 동안 배양한다. 그 후, 1.6)에 기술된 세척 단계를 반복하고 샘플을 4 °C에서 보관한다.
   5. ’30 min’ 샘플의 경우, 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 2% BSA가 포함된 20 µl PBS에 재현탁한다. 37 °C에서 30분 동안 배양한다. 단계 1.7.3-1.7.4를 따르고 샘플을 4 °C에서 보관한다.
      참고: sodium azide 대조군의 경우: 37 °C에서 30분 동안 배양할 때 2 % BSA와 0.1 % sodium azide가 첨가된 PBS를 사용한다.
   6. ’30 min + STV’ 샘플의 경우, 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 2% BSA가 포함된 20 µl PBS에 재현탁한다. 37 °C에서 30분 동안 배양한다. 그 후, 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 2% BSA와 0.1% sodium azide가 포함된 PBS(샘플 취급 중 내부화를 방지하기 위함)에 희석된 50 µl STV(섹션 3에서 결정된 농도 사용)에 재현탁한다. 얼음 위에서 30분 동안 배양한다. 단계 1.7.3-1.7.4를 따르고 샘플을 4 °C에서 보관한다.
      참고: sodium azide 대조군의 경우: 37 °C에서 30분 동안 배양할 때 2 % BSA와 0.1 % sodium azide가 첨가된 PBS를 사용한다.
8. 투과화를 위해 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 0.5% Triton X-10이 포함된 10 µl PBS에 재현탁한다. 상온(RT)에서 6분 동안 배양한다. 그 후, 1.6)에 기술된 세척 단계를 반복한다.
9. 4 °C에서 450 x g로 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 STV-Cy3가 포함된 PBS에 희석된 50 µl 2% BSA에 재현탁한다. (참고: STV-Cy3의 적절한 농도는 실험 시작 전에 결정되어야 한다. 1:20 농도로 시작하여 1:2,40까지 2배 희석하여 테스트한다. 본 실험에서는 1:1,0 희석이 최적인 것으로 나타났다.)
10. 상온(RT)의 암소에서 1시간 동안 배양한다. 그 후, 1.6)에 기술된 세척 단계를 반복하되, 펠렛을 20 µl 2% BSA 희석 PBS에 재현탁한다.
11. 유세포 분석법으로 샘플을 분석한다. 각 샘플에서 Cy3 양성 세포의 백분율을 결정한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Life Technologies	4196-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-10
D-Sucrose	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	50-06
딥웰 튜브 (1.2 ml 마이크로튜브)	Milian	82 0 01
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
초원심분리기 튜브	Hemotec HmbH	253070
Triton X-10	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Sodium azide	Fluka	71290
박테리아 뉴라미니다아제/시아리다아제	Sigma-Aldrich	N6514-1UN