흡광도 측정을 이용한 파지 매개 세균 성장 억제 평가

초록

출처: Niu, Y. D., et al. 고효율 설정을 통해 평가한 식중독성 병원균의 생물학적 제어를 위한 박테리오파지의 효과. J. Vis. Exp. (2021)

본 영상에서는 E.coli 박테리아 배양액에 대한 파지 칵테일의 용균 활성을 평가하기 위한 마이크로플레이트 기반 분석법을 보여줍니다. 또한, 광학 밀도의 변화를 통해 파지의 효능과 완전한 박테리아 억제에 필요한 농도를 어떻게 확인할 수 있는지 강조합니다.

프로토콜

1. 완충액 및 시약 준비

1. tryptic soy broth (TSB) 500 mL(TSB 분말 15 g 및 초순수 500 mL)를 제조하고 오토클레이브 멸균한다.
   참고: 이는 실온에서 최대 3개월 또는 4 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다.
2. tryptic soy agar (TSA) 500 mL(TSA 분말 20 g 및 초순수 500 mL)를 제조하고 오토클레이브 멸균한다.
   참고: 이는 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있다.
3. Phosphate Buffered Saline (PBS; NaCl 4 g, KCl 0.1 g, Na₂HPO₄ 0.77 g, KH₂PO₄ 0.12 g, 초순수 500 mL) 500 mL를 제조하고, 25 °C에서 pH를 7.2 ± 0.2로 측정 및 조정하고 오토클레이브 멸균한다.
   참고: 이는 4 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다.
4. 1 M MgSO₄ 200 mL(49.294 g 및 초순수 200 mL)를 제조하고 0.22 µm polyethersulfone 필터로 여과 멸균한다.
5. 10 mM MgSO₄가 포함된 TSB (mTSB; TSB 분말 15 g, 초순수 500 mL 및 1 M MgSO₄ 5 mL) 500 mL를 제조하고 오토클레이브 멸균한 후, 멸균된 배지를 실온까지 냉각시킨다. 무균 조작법을 적용한다. 세롤로지컬 피펫을 사용하여 1 M MgSO₄ 5.0 mL를 조심스럽게 옮기고, 가볍게 회전시켜 혼합한다.

2. 세균 배양액 준비

1. 세균 연구 실험실 배양물(BRLC)을 준비하려면, 냉동 보관함에서 글리세롤 스톡 바이알을 꺼내 실험실로 옮깁니다.
2. 일회용 접종 루프 또는 그와 동등한 도구를 사용하여 바이알에 담근 후, 접종균(동결 슬러시)을 긁어내어 2등급 생물 안전 작업대 내의 TSA 플레이트 또는 그와 동등한 배지에 도말합니다. 플레이트를 37 ± 2 °C에서 15−18시간 동안 배양합니다.
3. 준비된 BRLC 플레이트를 봉투에 넣어 4 °C에서 보관합니다.
   참고: BRLC의 일반적인 유효 기간은 제조 후 4 °C에서 14일입니다.
4. 테스트할 BRLC 플레이트에서 각 E. coli O157 균주-의 단일 콜로니를 10 mL의 TSB에 접종하고, 37 °C에서 18시간 동안 정적으로 배양하여 9 log10 CFU/mL에 도달하게 합니다.
5. (다음 날 아침) 10 mM MgSO₄가 포함된 mTSB를 사용하여 하룻밤 동안 배양한 각 E. coli O157 균주 배양액을 단계 희석하여 4-5 log10 CFU/ml(또는 기타 원하는 접종 수준)가 되도록 준비합니다.
6. 각 균주의 하룻밤 배양액을 동일한 부피로 혼합하여 총 4-5 log10 CFU/mL(또는 원하는 수준)가 되도록 세균 혼합물을 준비합니다.
7. 희석된 세균 배양액을 즉시 4 °C에 두어 사용 대기 상태로 보관합니다.
8. 접종 배양액을 10배 또는 100배로 희석하고, 이 희석액 0.1 mL를 TSA 플레이트에 분주하여 단일 콜로니를 얻습니다.

3. 파지 작동 용액의 준비

1. 표준 방법4에 따라 스크리닝할 각 파지의 고농도 워킹 스톡(≥10^8 PFU/mL)을 증식시킨다.
   참고: 파지 스톡의 일반적인 유효 기간은 플라스틱 병에 담아 다음 온도에서 보관 시 3개월입니다. 4 °C 생성 후.
2. 예를 들어 ~10^X와 같은 원하는 역가를 얻기 위해서는⁸ 용균 역학 측정을 위한 PFU/mL를 위해, 10mM의 MgSO4가 함유된 mTSB로 개별 파지 조제물을 희석하십시오.₄동일한 역가를 가진 각 작동 스톡(working stock)을 동일한 부피로 모든 가능한 조합으로 혼합하여 파지 칵테일을 준비하십시오.

4. 개별 파지 및 파지 칵테일의 in-vitro 용해 동역학 준비

1. 마이크로플레이트 분석을 설정하기 위해 멸균된 96-well 마이크로플레이트의 1-8번 컬럼에 각 파지의 10배 단계 희석액을 준비한다.
   참고: 한 가지 세균 균주에 대한 4종의 파지를 각 플레이트의 인접한 컬럼에 듀플리케이트(duplicate)로 테스트할 수 있다. 나머지 4개 컬럼은 파지가 없는 대조군과 mTSB 공시료(blank)를 위해 사용한다(그림 1).
2. 96-well 마이크로플레이트의 1번부터 12번 컬럼 웰에 mTSB 180 µL를 넣는다.
3. 마이크로플레이트의 첫 번째 행(Row A) 1-8번 웰에 희석된 개별 파지 또는 파지 칵테일(~108 PFU/mL) 20 µL를 추가한다.
4. 파지 미첨가 대조군 및 공시료 대조군을 위해 9, 10, 11번 컬럼의 첫 번째 웰에 mTSB 20 µL를 추가한다.
5. 12채널 피펫을 사용하여 플레이트를 희석한다. 행에서 행으로 20 µL씩 옮긴다. 완만한 반복 흡입 및 분출(최소 5회 이상)을 통해 내용물을 잘 혼합하고, 희석 단계마다 팁을 교체한다. 마지막 행(Row H)에서 20 µL를 제거한다.
   참고: 교차 오염을 방지하기 위해 필터 팁 사용을 권장한다.
6. 각 균주별로 리저버(reservoir)를 설정한다. 1 mL 피펫을 사용하여 희석된 배양액 2-3 mL를 리저버로 옮긴다. 1-10번 컬럼의 경우, 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 희석된 세균 배양액 20 µL를 추가한다. 각 추가 단계마다 팁을 교체한다.
7. 마이크로플레이트를 덮고 원하는 조건(예: 37 °C에서 10 h 또는 22 °C에서 22 h)으로 배양한다.
8. 2 h 또는 기타 원하는 간격으로 인큐베이터에서 마이크로플레이트를 꺼낸다.

결과

그림 1: 96-웰 마이크로플레이트 분석의 제안된 배치도. 멸균된 96-웰 마이크로플레이트의 1-8번 열에 각 파지의 10배 연속 희석액을 준비합니다. 한 종류의 박테리아 균주에 대한 4종의 파지를 각 플레이트의 인접한 열에 2반복으로 테스트할 수 있습니다. 나머지 열은 대조군으로 사용합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
필수 소모품, 시약 및 장비
황산마그네슘 칠수화물	Sigma	1374361
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipet-Lite 피펫, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
피펫 팁 RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention	METTLER TOLEDO	30389213
피펫 팁 SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
저장조	METTLER TOLEDO	89094-662
뚜껑이 있는 멸균된 투명 96-웰 평저 폴리스티렌 마이크로플레이트	Fisher	168055
트립틱 소이 아가 (TSA)	Sigma	105458-0500
트립틱 소이 브로스 (TSB)	시그마	105459-0500
T자형 세포 도말기	VWR	76299-566
기기 및 장비
소형 미생물 배양기	Fisher	50125590H
다각형 마그네틱 바	Fisher	14-512-125	길이: 20 mm
Synergy Neo2 하이브리드 멀티모드 리더	Fisher	BTNEO2M
소프트웨어
SAS	SAS Institute	9.4