1. 세포 배양, 바이러스 감염 및 EdC (5-Ethynyl-2′-deoxycytidine) 표지 (그림 1) 다음 프로토콜은 바이러스를 다루는 작업을 포함합니다. 바이러스 및 기타 생물학적 제제의 안전한 취급에 관한 소속 기관의 생물 안전 지침을 참조하십시오. 본 프로토콜은 University of Pittsburgh의 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 합류(confluent) 상태의 MRC-5 (Medical Research Council cell strain 5) 세포가 담긴 150 cm2 조직 배양 플라스크를 트립신 처리하고, 10% FBS가 첨가된 10 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)이 들어 있는 600 cm2 조직 배양 플레이트로 세포를 옮깁니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 3~4일 동안 배양하여 합류 상태 및 정지기에 도달하게 합니다. 합류된 60 cm2 디시에는 약 7 x 107개의 세포가 포함되어 있습니다. 각 조건당 1개의 플레이트와 각 대응하는 음성 대조군당 1개의 플레이트를 준비합니다. 참고: 후속 단계에서 vDNA (바이러스 DNA)만 표지 및 정제되도록 하려면, 세포 DNA 복제를 억제하기 위해 세포가 반드시 정지기에 도달해야 합니다. 참고: 각 시료에는 EdC를 첨가하지 않고 동일한 감염 조건 및 시점에서 준비한 보완적인 비표지 음성 대조군이 필요합니다. 참고: 유사한 세포 성장, 감염, EdC 표지 조건 및 시점에서 이미징을 통한 세포 DNA의 표지 여부를 테스트하기 위해, 이 실험의 축소 버전을 병행하여 수행해야 합니다 (단계 2 참조). 7 x 108 PFU (plaque-forming units)의 HSV-1을 7 mL의 차가운 Tris-Buffered Saline (TBS)에 희석합니다. 성장 배지를 제거하고 37 °C에서 보관합니다. 감염을 위해 희석된 바이러스 7 mL를 MRC-5 세포에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 흔들어줍니다(rock). 흡착 후, 접종액을 제거하고 실온의 TBS 50 mL로 헹군 다음 원래의 성장 배지로 교체합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 이 단계는 각 실험 조건 및 음성 대조군에 대해 수행되어야 합니다. 참고: 바이러스 dUTPase (UL50 유전자) 및/또는 uracil glycosylase (UL2 유전자)의 발현이 결핍된 HSV-1 돌연변이체를 사용하면 EdC 표지 효율을 높일 수 있습니다. HSV-1 dUTPase는 기질 특이성이 낮아 여러 뉴클레오사이드 유사체의 활성화를 감소시킬 수 있습니다. EdC로 바이러스 게놈을 표지합니다. 유입 게놈 (1.3.1.), 복제 게놈 (1.3.2.) 또는 바이러스 복제 분기점 (1.3.3.)을 표지하는 지침을 따르십시오. 참고: 후속 단계에서 각각 유입 게놈, 복제 게놈 또는 복제 분기점을 분석할 것인지에 따라 단계 1.3.1, 1.3.2 또는 1.3.3 중 하나만 수행해야 합니다. 참고: EdC 대신 EdU 또는 f-ara EdU를 사용할 수 있습니다. 뉴클레오사이드 유사체의 독성을 모니터링하고 최소화해야 합니다. 단계 1.2에서 감염을 수행하기 위해 미리 표지된 스톡을 사용하고, 복제되지 않은 vDNA를 조사하려면 감염 후 4시간(hpi) 이내에 단계 2 또는 3으로 진행하십시오 (그림 1A). 참고: 이전에 설명된 프로토콜 25를 사용하여 미리 표지된 바이러스 스톡을 준비하십시오. 바이러스 스톡은 잔류 EdC를 제거하기 위해 G-25 컬럼을 통과시켜야 합니다. 감염된 세포의 배양 배지에 5 ~ 25 µM EdC를 2 ~ 4시간 동안 첨가하여 복제 중인 vDNA를 표지합니다 (그림 1B). 첨가 전, EdC를 1 mL의 성장 배지에 희석하십시오. 바이러스 복제 분기점을 표지하려면, vDNA 복제가 시작된 후 (≥4 hpi), 5 ~ 25 µM EdC로 5~20분 동안 복제 중인 vDNA를 펄스 표지(pulse label)합니다. 체이스(chase)를 위해 25 ~ 10 µM 2´deoxycytidine (deoxyC)이 포함된 체이스 배지로 3회 헹군 다음, 체이스 배지 존재 하에 추가로 20~40분 동안 배양합니다 (그림 1C). 참고: 펄스 및 체이스 배지는 사용 전 37 °C, 5% CO2 조건으로 평형화되어야 합니다. 참고: 펄스-체이스 실험에서는 뉴클레오사이드가 세포 내로 들어가 복제 DNA에 통합되기 전 인산화되는 데 걸리는 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 이는 실험적으로 결정되어야 합니다. 참고: 펄스-체이스 실험의 해상도를 결정하려면, 사용된 실험 조건 하에서 바이러스 복제 속도를 계산하십시오. 이는 단일 단계 성장 시간 과정 동안 바이러스 게놈의 정량적 PCR을 통해 결정할 수 있습니다. Dembowski, J. A., Deluca, N. A. 연관된 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp. (2017)
이 비디오에서는 정지기(stationary-phase) 포유류 세포에 HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1)을 감염시킨 후, 숙주 및 바이러스 복제 기구를 사용하여 바이러스 게놈을 복제하는 과정을 보여줍니다. 합성 뉴클레오사이드 유사체를 새로 합성된 바이러스 DNA에 통합시켜 복제 중인 게놈을 표지하며, 이후 이를 분리하여 결합된 숙주 및 바이러스 단백질의 단백질체 분석을 수행합니다.
