출처: Dembowski, J. A., 외. 연관 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp. (2017). 이 비디오는 클릭 화학 및 자기 비드 정제를 사용하여 세포핵에서 단백질-바이러스 DNA 복합체를 분리하는 과정을 보여줍니다. 프로토콜에는 알킨 수정 뉴클레오타이드를 이용한 바이러스 게놈 표지, 클릭 반응을 통한 비오틴화, 그리고 스트렙타비딘 코팅 자기 비드에의 결합 과정이 포함됩니다. 세척 및 열 용출 후, 정제된 복합체를 수집하고 급속 냉동하여 후속 분석을 위해 보관합니다. Dembowski, J. A., 외.연관된 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp.. (2017).
이 영상은 클릭 화학과 자성 비드 정제를 이용하여 세포 핵으로부터 단백질-바이러스 DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜에는 알킨-수식 뉴클레오타이드로 바이러스 게놈을 표지하고, 클릭 반응을 통해 비오틴화한 뒤, 스트렙타비딘이 코팅된 자성 비드에 결합시키는 과정이 포함됩니다. 세척 및 열 용출 후, 정제된 복합체를 수집하여 급속 냉동시킨 뒤 후속 분석을 위해 보관합니다.
프로토콜
1. vDNA 및 관련 단백질의 정제
참고: 모든 완충액과 시약은 사용 전 얼음에 의해 냉각되어야 하며, 별도의 지시가 없는 한 모든 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
핵 수확. 참고: 핵 분리 전에 포름알데히드를 사용하여 단백질을 DNA에 가교결합(crosslink)할 수 있습니다. 이 경우 스트렙타비딘(streptavidin) 코팅 비드에서 DNA를 정제할 때 더 엄격한 세척 조건을 사용할 수 있습니다.
배양액을 20 mL 핵 추출 버퍼(NEB)로 교체하고 4 °C에서 가끔 흔들어주며 20분 동안 배양합니다. 현미경으로 핵이 관찰될 것입니다.
셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 핵을 긁어모아 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 2,500 x g로 10분 동안 원심분리하여 핵 펠릿을 형성하고 상층액을 제거합니다. 참고: 트립판 블루(Trypan blue) 염색을 통해 세포로부터 핵이 분리되었는지 확인할 수 있습니다.
10 mL 인산염 완충 식염수(PBS) 내에서 핵 펠릿을 부드럽게 풀어준 후, 15-mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4 °C에서 2,500 x g로 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. PBS를 완전히 제거합니다. 참고: 핵을 냉동 보관할 수 있으며, 이 단계에서 프로토콜을 일시 중단할 수 있습니다. 이를 위해 핵 펠릿을 500 µL 냉동 버퍼에 부드럽게 재부유시키고 튜브를 에탄올/드라이아이스 배스에 넣습니다. 냉동된 핵은 -80 °C에 보관합니다. 사용 전, 핵을 상온에서 해동하고 빠르게 얼음에 옮긴 후, 10 mL PBS를 첨가하고 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 그 다음 4 °C에서 2,500 x g로 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 만들고 PBS를 완전히 제거합니다. 핵을 냉동하면 수율이 감소할 수 있습니다.
5-에티닐-2′-데옥시시티딘(EdC)으로 표지된 바이러스 DNA(vDNA)에 비오틴-아지드(biotin-azide)를 공유 결합시킵니다.
10 mL 피펫으로 5회 정도 부드럽게 파이펫팅하여 핵 펠릿을 10 mL 클릭 반응 믹스[재료 표 참조]에 재부유시킵니다. 참고: 클릭 반응 믹스에 포함된 시약들을 명시된 순서대로 첨가하는 것이 중요합니다.
4 °C에서 1시간 동안 회전시킵니다. 회전시키는 동안 버퍼 B1, B2 및 B3[재료 표 참조]를 준비하여 냉각시킵니다.
4 °C에서 2,500 x g로 10분 동안 원심분리하여 핵 펠릿을 형성합니다. 클릭 반응 믹스를 완전히 제거하고, 10 mL PBS에 부드럽게 재부유시킨 후 4 °C에서 2,500 x g로 10분 동안 원심분리하여 펠릿을 세척합니다.
핵 펠릿을 1 mL PBS에 부드럽게 재부유시키고 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 2,500 x g로 10분 동안 원심분리하여 핵 펠릿을 형성합니다. PBS를 완전히 제거하고 액체 질소로 급속 냉동합니다. 참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중단할 수 있으며, 냉동된 핵은 -80 °C에 보관할 수 있습니다. 냉동-해동 과정이 후속 용해(lysis)에 도움이 되므로, 같은 날 단계 1.3으로 진행하더라도 핵을 급속 냉동하는 것이 권장됩니다.
핵을 용해하고 DNA를 단편화합니다.
얼음 위에서 핵을 해동하고 파이펫팅을 통해 500 µL 버퍼 B1에 재부유시킵니다. 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.
3 mm 마이크로팁 프로브를 사용하여 40% 진폭에서 30초씩 6회 샘플을 초음파 처리(sonicate)합니다. 펄스 사이에 샘플을 30초 동안 얼음에 둡니다. 초음파 처리 후 샘플은 탁하지 않고 투명하게 보여야 합니다. 참고: 초음파 처리 조건은 개별 초음파 분쇄기에 맞게 최적화해야 합니다.
4 °C에서 14,000 x g로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편 펠릿을 형성합니다. 펠릿 크기가 상당히 감소해야 합니다. 상층액을 100 µM 세포 스트레이너로 필터링하고 통과액을 회수합니다.
필터링된 상층액에 500 µL 버퍼 B2를 첨가합니다. 이 샘플 중 900 µL가 단계 1.4.2에서 사용됩니다.
DNA 분리를 위해 각 조건의 분주액(50 µL 또는 전체 부피의 1/20)을 취해 50 µL 2x sodium dodecyl sulfate (SDS)-bicarb 용액[재료 표 참조]을 첨가합니다. DNA 분리 프로토콜을 진행합니다.
입력 단백질(input protein) 확인을 위해 각 조건의 분주액(50 µL 또는 전체 부피의 1/20)을 취해 50 µL 2x Laemmli 샘플 버퍼를 첨가하고, 액체 질소로 냉동하여 -80 °C에 보관합니다.
비오틴화된 DNA를 스트렙타비딘 코팅 비드에 결합시킵니다.
비드 슬러리 300 µL를 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮겨 Streptavidin T1 마그네틱 비드를 준비합니다. 샘플당 하나의 비드 튜브를 준비합니다. 볼텍싱하여 재부유시키고, 자석을 사용하여 비드를 분리한 후 세척 버퍼를 흡입하는 방식으로 1 mL 버퍼 B2로 비드를 3회 세척합니다. 참고: 최적화된 결합 조건은 수율을 최대화하고 배경 결합(background binding)을 최소화합니다. 실험적으로 Streptavidin T1 마그네틱 비드가 아가로스 비드 및 다른 스트렙타비딘 비드보다 결합 용량이 훨씬 크며, Streptavidin C1 비드보다 배경 결합이 적은 것으로 확인되었습니다(그림 1A).
세척된 비드에 단계 1.3.4의 샘플 900 µL를 첨가하고 4 °C에서 밤새 회전시킵니다. 참고: 샘플을 첨가한 후에는 비드를 볼텍싱하지 마십시오. 참고: 표지되지 않은 음성 대조군에서 상당량의 DNA 또는 단백질이 분리되는 경우, 배경 결합을 줄이기 위해 이 단계를 밤새 처리하는 대신 4시간으로 단축할 수 있습니다.
비드를 세척하고 vDNA 및 관련 단백질을 용출합니다. 참고: 나머지 단계에서는 필터 팁을 사용하는 것이 권장됩니다.
샘플을 마그네틱 마이크로 튜브 랙에 놓고 상층액을 제거한 후, 1 mL 버퍼 B2에 부드럽게 재부유시키고 4 °C에서 5분 동안 회전시킵니다.
단계 1.5.1을 3회 반복합니다.
샘플을 마그네틱 마이크로 튜브 랙에 놓고 상층액을 제거한 후, 1 mL 버퍼 B3에 부드럽게 재부유시키고 4 °C에서 5분 동안 회전시킵니다.
결합된 DNA 분리를 위해 비드 혼합물 100 µL(전체 부피의 1/10)를 새 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 자석에 대고 상층액을 제거한 후, 비드를 100 µL 1x sodium dodecyl sulfate 또는 SDS-bicarb 용액에 재부유시키고 DNA 분리 프로토콜을 진행합니다.
단계 1.5.3의 나머지 900 µL 비드 혼합물이 담긴 튜브를 자석에 대고 상층액을 제거한 후, 비드를 50 µL 2x Laemmli 샘플 버퍼에 재부유시켜 단백질과 DNA-단백질 복합체를 용출합니다.
샘플을 95 °C에서 15분 동안 가열하고, 볼텍싱한 후 마이크로 원심분리기로 빠르게 스핀 다운하고 자석을 적용합니다. 용출액을 새 튜브로 옮겨 급속 냉동하고 -80 °C에 보관합니다. 참고: 가열하는 동안 튜브가 열리지 않도록 캡 락(caps lock)을 사용하십시오. 참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중단할 수 있으며, 샘플을 -80 °C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
표준 절차에 따라 Coomassie Blue 염색, 웨스턴 블로팅 또는 질량 분석법으로 단백질 샘플을 분석합니다. 대표적인 결과는 그림 1 및 2에 나와 있습니다. 참고: 질량 분석에 충분한 단백질 수율이 확보되었는지 확인하기 위해, 각 샘플의 7.5 µL는 Coomassie Blue 염색 분석에, 7.5 µL는 대표적인 바이러스 게놈 관련 단백질(ICP4, ICP8 또는 UL42)의 웨스턴 블로팅 분석에 사용합니다. 입력 단백질 수준을 제어하기 위해 단계 1.3.6의 동일한 부피의 용해물을 함께 분석합니다. 남은 샘플(35 µL)은 질량 분석법으로 분석합니다.
결과
그림 1: 대표적인 단백질 정제 결과. (A) 여러 종류의 streptavidin 코팅 비드를 사용하여 정제 단계를 수행했을 때의 단백질 수율 비교. 단백질 수율을 비교하기 위해 EdC가 존재하는 상태(+)에서 감염을 수행하였거나, 배경 결합을 비교하기 위해 EdC가 없는 상태(-)에서 감염을 수행하였다. 감염 및 EdC 표지는 다음과 같이 수행되었다., 그리고 유사한 양의 서로 다른 종류의 스트렙타비딘 코팅 비즈를 사용하여 DNA-단백질 복합체를 정제하였다. 상단 패널: 스트렙타비딘 코팅 아가로스 비즈 또는 Streptavidin M-280으로 정제한 후의 단백질 수율 비교. 하단 패널: Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 또는 Streptavidin T1으로 정제한 후의 단백질 수율 비교. 웨스턴 블로팅은 바이러스 단백질 ICP4에 대한 항체를 사용하여 수행되었다. 비교를 위해 정제된 ICP4를 첫 번째 레인에 나타내었다. 레인에서 유사한 강도의 ICP4를 관찰하기 위해 하단 패널의 노출 시간을 더 길게 설정해야 했다. "280" 상단 패널과 같이. (BEdC 표지 시간에 따른 대표적인 단백질 정제 결과가 제시되어 있다. 감염 및 EdC 표지를 수행한 후, Streptavidin T1 비드를 사용하여 DNA-단백질 복합체를 정제하였다. EdC 표지를 0, 20, 40 또는 60분 동안 수행하였으며, Coomassie Blue 염색(상단) 및 웨스턴 블로팅(하단) 결과를 나타낸다. 웨스턴 블로팅은 ICP4, UL42 또는 GAPDH에 특이적인 항체를 사용하여 수행하였다. 용출액 샘플은 단계 1.5.5에서, 용해물 샘플은 단계 1.3.6에서 취하였다. 화살표는 streptavidin을, L은 단백질 사다리를 나타낸다.
그림 2: 단백질체학 데이터를 제시하는 다양한 방법의 예시. (A) 파이 차트는 6 hpi에서 정제된 바이러스 게놈과 연관된 단백질 용출물의 질량 분석법으로 확인된 단백질들을 요약하여 보여준다. 값은 각 기능 범주별로 확인된 단백질의 수를 나타낸다. T는 확인된 총 단백질 수를 나타낸다. 색상은 다음 범주를 나타낸다: 보라색 - RNA 가공, 빨간색 - 전사, 녹색 - 염색질 리모델링, 주황색 - DNA 복제, 노란색 - 핵 수송, 청록색 - 세포골격, 진파란색 - HSV 구조 단백질, 회색 - 기타/알 수 없음. (B) 벤 다이어그램은 6, 8 또는 12 hpi에서 바이러스 게놈과 연관된 것으로 확인된 단백질의 중첩을 묘사한다. (C) STRING 맵은 5분간의 EdC 펄스 후 바이러스 복제 포크에 농축된 단백질을 묘사한다. 라벨링되지 않은 음성 대조군과 비교하여 5배 농축된 인간 단백질이 기능적 상호작용 맵에 표시되어 있으며, 이 맵은 고신뢰도 상호작용만 표시하도록 데이터 설정을 적용한 STRING을 사용하여 생성되었다. 상호작용 매핑에는 유전자 이름이 사용되었다. 원은 동일한 생물학적 과정에서 기능하는 단백질들을 나타낸다.
재료
이 논문에 사용된 재료 목록
이름
회사
카탈로그 번호
댓글
MRC-5 세포
ATCC
CCL-171
소 태아 혈청 (FBS)
Gibco
26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
Gibco
12800-082
10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (플라스크 배양 시) 또는 30 mM (디쉬 배양 시) sodium-bicarbinate로 보충
600 cm² 조직 배양 디쉬
Thermo Fisher Scientific
166508
Tris 완충 식염수 (TBS), pH 7.4
137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 스톡
1x10⁹ PFU/mL 이상의 타이터(titer)를 가진 스톡이 가장 적합함
Sephadex G-25 컬럼 (PD-10 탈염 컬럼)
GE Healthcare
17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Fisher Scientific
D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)
Sigma-Aldrich
T511307
DMSO에 녹여 40 mM 스톡을 제조하고, 분주하여 -20 °C에 보관
2´-deoxycytidine (deoxyC)
Sigma-Aldrich
D3897
물에 녹여 40 mM 스톡을 제조하고, 분주하여 -20 °C에 보관
핵 추출 완충액 (Nuclear Extraction Buffer, NEB)
신선하게 제조 (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
셀 스크레이퍼 (Cell scraper)
Bellco glass
7731-22000
사용 전 오토클레이브 멸균
트리판 블루 용액 (Trypan blue solution)
Sigma-Aldrich
T8154
PBS, pH 7.2 (10x)
1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (사용 전 멸균수로 1x로 희석)
황산구리(II) 오수화물 (CuSO₄·5H₂O)
Fisher Scientific
C489
100 mM 스톡을 제조하여 4 °C에서 최대 1개월간 보관
(+) Sodium L-ascorbate
Sigma-Aldrich
A4034
100 mM 스톡을 신선하게 제조하여 사용 전까지 얼음 위에 보관
Biotin azide
Invitrogen
B10184
DMSO로 10 mM 스톡을 제조하고, 분주하여 -20 °C에서 최대 1년간 보관
클릭 반응 믹스 (Click Reaction Mix)
표시된 순서대로 시약을 추가하여 사용 직전에 제조 (10 mL 기준: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO₄, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
Complete Protease Inhibitor Cocktail
Roche
11697498001
물 1 mL에 녹여 50x 스톡을 제조하여 4 °C에서 최대 1주일간 보관하거나, 50 mL 완충액에 1정(pill)을 직접 추가
동결 완충액 (Freezing buffer)
신선하게 제조 (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1
신선하게 제조 (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2
신선하게 제조 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3
신선하게 제조 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
3 mm 마이크로팁 프로브가 장착된 Vibra Cell Ultra Sonic Processer
Sonics
VCX 130
셀 스트레이너 (Cell strainer)
Falcon
352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1
Life Technologies
65601
DynaMag-2 마그넷
Life Technologies
12321D
미니 튜브 로테이터 (Mini-Tube Rotator)
Fisher Scientific
260750F
2x Laemmli 샘플 완충액
SDS 400 mg, 100% glycerol 2 mL, 1 M Tris (pH 6.8) 1.25 mL, bromophenol blue 10 mg을 물 8 mL에 혼합. 4 °C에서 최대 6개월간 보관. 사용 전 1 M DTT를 최종 농도 200 mM이 되도록 추가
