카테터 관련 요로 감염을 모델링하기 위한 3D 프린팅 실리콘 코팅 장치

초록

근원:
오션 E. 클라크¹, 로미 A. 돕¹, 톰 헤이셀¹, 조앤 L. 포더길¹, 다니엘 R. 닐<sup>2

1</sup>리버풀 대학교, ² 던디 대학교

이 비디오는 카테터 관련 요로 감염을 시뮬레이션하기 위해 요로 카테터의 내부 표면을 모방하는 3D 프린팅 실리콘 코팅 장치의 사용을 보여줍니다.

프로토콜

샘플 수집과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. Flexipeg 모델의 적층 제조

1. 페그(페그 뚜껑당 24개 페그 필요)와 스테레오리소그래피(100μm 층 높이)를 사용하여 고온 안정 수지로 페그 뚜껑을 인쇄합니다.
   메모: 페그에는 고온 안정 수지가 사용되며, 페그 뚜껑은 실험 전에 오토클레이브 멸균할 수 있습니다.
2. 60% 충전재가 있는 FDM(융합 증착 모델링)을 사용하여 금형 구성 요소와 시험관 랙의 부품을 모두 3D 프린팅합니다.
   메모: 금형 및 시험관 랙은 에탄올 멸균이 가능하고 고온에서 안정성이 필요하지 않기 때문에 내구성이 뛰어난 모든 수지가 FDM에 적합합니다.
3. 모델 구성 요소가 올바르게 인쇄되었는지 확인하고 70% 에탄올을 사용하여 인쇄 과정에서 과도한 잔여물을 제거합니다.
4. 그림 1과 같이 실리콘 매트 몰드를 조립하고 필요한 경우 테이프로 측면을 제자리에 고정합니다.

2. Flexipeg 모델 준비

1. 실리콘 매트 준비
   1. 실리콘 베이스 18g(촉매 폴리디메틸실록산(PDMS), 축합 경화)에 10:1 베이스)를 비커에 넣고 잘 섞일 때까지 촉매 2g을 부드럽게 섞습니다.
      메모: 금형 내부에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 실리콘 혼합물을 과도하게 휘젓지 마십시오.
   2. 결합된 실리콘 혼합물을 FDM 인쇄 몰드에 붓고 몰드의 측면과 상단에서 여분의 실리콘 혼합물을 닦아냅니다. 실온(RT)에서 하룻밤(최소 18시간) 경화시킵니다.
   3. 금형에서 매트를 제거하고 측면에서 여분의 실리콘을 다듬습니다. 그림 1과 같이 매트가 페그 뚜껑 안에 맞는지 확인하십시오.
2. 페그 코팅
   1. 페그를 실리콘 매트(매트당 24개)에 삽입하고 테이프를 사용하여 매트를 페그 뚜껑 또는 매트와 비슷한 크기의 플라스틱 트레이에 고정합니다.
   2. 실리콘 베이스 27g을 얕은 플라스틱 트레이(96웰 플레이트와 거의 동일한 크기)에 넣고 잘 섞일 때까지 촉매 3g을 완전히 혼합합니다.
   3. 못이 아래를 향하도록 못 뚜껑을 뒤집고 즉시 못을 실리콘 혼합물에 담그십시오. 페그 뚜껑을 뒤집고 여분의 실리콘이 페그 아래로 떨어지도록 하고 페그가 실온에서 밤새 경화되도록 합니다.
      메모: 빠른 경화 실리콘(6-8시간 완전 경화, 40-60분 작업 시간)은 경화 전에 계속 물방울/흐름합니다. 따라서 과잉은 경화 중에 나머지 페그를 코팅하므로 담글 때 전체 페그를 PDMS로 코팅하는 것은 필수적이지 않습니다.
   4. 경화되면 2.2.2-2.3단계를 반복합니다. 페그가 PDMS에서 세 번 코팅될 때까지. 두 번째 코팅 단계를 진행하기 전에 첫 번째 코팅층이 완전히 경화되었는지 확인하십시오.
      메모: 최종 페그 코팅은 눈에 띄는 결함 없이 두께가 <2mm여야 합니다. RT에서 하룻밤 배양한 후에도 실리콘이 끈적거리면 24시간 동안 경화시키고 못이 여전히 만졌을 때 끈적거리면 코팅을 폐기합니다.
   5. 멸균 메스를 사용하여 실리콘 코팅 못의 바닥 주변(가능한 한 바닥에 가까움)을 다듬어 코팅 설정에서 못을 제거합니다.
      메모: 원하는 수의 못과 실리콘 매트가 준비될 때까지 이 과정을 반복해야 합니다. 페그 코팅 공정에 사용되는 과도한 PDMS는 경화 전에 새로운 실리콘 매트를 주조하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 모델 설정
   1. 코팅된 페그를 실리콘 매트에 삽입하고 그림 1과 같이 매트를 페그 뚜껑에 고정합니다.
   2. 못 뚜껑/실리콘 매트(페그 베이스에 부착됨)의 밑면을 오토클레이브 테이프로 덮어 못을 제자리에 고정합니다. 페그 뚜껑 설정을 밀봉된 오토클레이브 백에 넣고 사용하기 전에 오토클레이브를 멸균합니다.
      메모: 페그 뚜껑의 페그는 하나의 단일 방향으로 96웰 플레이트에 맞습니다. 페그 설정을 테이프로 붙인 후 여분의 96웰 플레이트에서 페그의 정렬을 확인하고 그에 따라 올바른 뚜껑 방향으로 오토클레이브 테이프에 라벨을 붙입니다.

3. 모델 접종

1. 세균 배양의 준비
   1. Luria-Bertani(LB) 국물 10mL에 고체 배지에서 성장한 박테리아 콜로니의 루프를 현탁시켜 테스트 중인 박테리아 분리주의 하룻밤 배양을 준비합니다. 교반하면서 37°C에서 밤새도록 배양합니다(18시간).
      메모: Flexipeg 생물막 모델에서 사용하려면 최소 3개의 생물학적 복제가 권장됩니다.
   2. 1mL의 최종 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 배양을 0.1(플레이트 희석 후 약 10⁸ 콜로니 형성 단위(CFU)/mL)의 OD_600nm로 정규화합니다.
2. 마이크로플레이트 설정 및 접종
   1. 135μL의 풀링된 인간 소변(PHU)을 그림 1(8)의 플레이트 레이아웃에 따라 96웰 플레이트의 각 테스트 웰에 분취합니다. 각 웰은 하나의 기술 복제를 나타냅니다(생물학적 복제당 최소 n = 3개의 기술 복제가 필요함).
      메모: 사용자가 원하는 경우 PHU 대신 인공 소변 배지(AUM)를 활용할 수 있습니다.
   2. 각 테스트 웰에 15μL의 정규화된 하룻밤 배양을 접종하여 최종 웰 부피를 150μL로 만듭니다. 접종물의 CFU/mL를 검증하기 위해 연속 희석을 위해 최소 100μL의 정규화된 하룻밤 배양을 예약합니다.
   3. 150μL의 멸균 PHU를 관련 웰에만 분취하여 음성 대조군을 준비합니다.
   4. 마이크로플레이트 설정 후 페그를 각각의 웰에 삽입하고(페그의 오토클레이브 멸균 전에 결정됨) 페그 뚜껑이 플레이트 표면과 같은 높이인지 확인합니다. 마이크로플레이트 뚜껑으로 페그 뚜껑을 덮고 필요한 경우 오토클레이브 테이프로 제자리에 고정합니다.
   5. 페그 모델을 축축한 파란색 롤이 있는 밀봉된 플라스틱 통/백에 넣어 증발을 방지하고 37°C에서 24시간 동안 정적으로 배양합니다.
3. 접종 검증
   1. 180μL의 PBS를 96웰 마이크로플레이트의 첫 번째 열의 2-6행에 분취하고 예약된 100μL의 정규화된 하룻밤 배양액을 첫 번째 웰에 추가합니다.
   2. 첫 번째 웰에서 정규화된 하룻밤 배양액 20μL를 제거하고 두 번째 웰에 분취하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
   3. 초기 접종물이 최종 웰(1 × 10⁵)으로 희석될 때까지 3.3.2단계를 반복합니다.
   4. 각 희석액의 10μL 스폿을 적절한 고체 배지에 세 번 도금합니다. 37°C에서 밤새 정적으로 배양합니다.
   5. 배양 후, 각 지점의 콜로니 수를 세어 접종물의 실제 CFU/mL를 계산합니다.

4. 생물막 정량화

1. 페그 가공
   1. 배양 후, 마이크로플레이트에서 페그 모델을 제거하고 화염 아래 또는 미생물 안전 캐비닛(페그가 위를 향함) 내에서 반전시킵니다. 마이크로플레이트는 폐기하십시오.
   2. 페그 뚜껑을 멸균 PBS의 180μL 분취량이 들어 있는 신선한 마이크로플레이트로 옮겨 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 총 3단계의 세척 단계에 대해 신선한 PBS에서 두 번 반복합니다.
      메모: 표면 관련 생물막의 손상을 방지하려면 각 마이크로플레이트에서 페그 뚜껑을 제거할 때(즉, 웰 가장자리를 만질 때) 페그를 방해하지 마십시오.
2. CFU/mL 열거(생물막 관련)
   1. 화염 아래에서 또는 미생물 안전 캐비닛에서 무균 상태로 작업하면서 그림 1과 같이 멸균 유리 시험관으로 튜브 랙(1.2단계에서 제조)을 설치하고 페그 뚜껑에 맞는 랙 상단을 부착합니다.
   2. 무균 상태에서 멸균 PBS 600μL를 각 시험관에 분취합니다.
   3. 못 뚜껑을 랙에 놓고 못을 선반의 튜브와 일직선으로 놓습니다. 페그 뚜껑의 오토클레이브 테이프를 제거합니다.
   4. 멸균 겸자를 사용하여 페그 뚜껑을 통해 페그를 아래에 정렬된 해당 시험관에 밀어 넣습니다.
   5. 튜브 뚜껑을 교체하고 각 튜브를 60초 동안 소용돌이치게 하여 페그 표면에서 생물막 관련 세포를 분해합니다.
   6. 각 튜브에서 100μL를 제거하고 멸균 PBS에서 3.3단계에서 앞서 설명한 대로 연속적으로 희석합니다.
   7. 혈청학적 피펫 플레이트를 사용하여 적절한 고체 배지에 각 희석액의 10μL 스팟을 넣고 밤새 37°C에서 정적으로 배양합니다.
   8. 배양 후, 각 희석 플레이트의 콜로니 수를 계산하고 이를 사용하여 CFU/mL를 계산합니다.
3. 크리스탈 바이올렛 염색
   1. 180μL의 0.1%(w/v) 크리스탈 바이올렛(멸균수)을 96웰 마이크로플레이트의 24개 테스트 웰에 분취합니다.
   2. 헹군 페그 모델(페그 및 페그 뚜껑)을 마이크로플레이트의 해당 웰에 삽입합니다. 실온에서 20분 동안 정적으로 배양합니다.
   3. 배양 후 마이크로플레이트에서 페그 모델을 제거하고 마이크로플레이트를 폐기합니다.
   4. 적절한 크기의 욕조에 수돗물에 설치된 못 전체를 부드럽게 저으면서 헹굽니다. 세 번 반복합니다.
   5. 페그 모델을 뒤집고 페그가 RT에서 완전히 건조되도록 합니다.
   6. 180μL의 30% 아세트산을 신선한 96웰 마이크로플레이트에 분취하고 건조된 페그 모델을 해당 웰에 삽입합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
   7. 마이크로플레이트에서 페그 모델을 제거하고 마이크로플레이트 리더 또는 분광 광도계를 사용하여 염색된 웰의 OD_540nm 를 읽습니다.
   8. 페그의 생물막 형성을 계산하려면 염색된 음성 대조군 페그의 OD_540nm 를 평균화하고 테스트 중인 페그의 평균에서 뺍니다.

결과

그림 1: Flexipeg 모델 설정의 개략도. (1) 생물막 형성을 위해 요로 카테터 표면을 복제하기 위해 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 코팅된 단일 Flexipeg. (2) (3) 개별 못을 제자리에 고정하는 실리콘 매트와 (4) 96웰 플레이트에 맞는 뚜껑으로 구성된 Flexipeg 생물막 장치. 구성 요소는 다음에 의해 적층 제조됩니다.

고온 수지를 사용한 광조형(층 높이 100μm). (5) (6) 페그 뚜껑...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 마이크로플레이트	그라이너	650161	U자형/둥근 바닥.
아세트산	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99.7% ACS 시약.
크리스탈 바이올렛	머 크	61135-25G
개별 페그	사내	3D 프린팅할 Flexipeg 구성 요소	고온 안정 수지를 사용한 적층 제조(Flexipeg 모델당 24개의 페그 필요). Protolabs (NL)의 Formlabs 고온 수지를 사용하여 제조되었습니다.
루리아-베르타니(LB) 국물	네오젠	NCM0088B	LB 국물(밀러).
96웰 플레이트에 맞는 뚜껑	사내	3D 프린팅할 Flexipeg 구성 요소	고온 안정 수지를 사용한 적층 제조.
실리콘 매트를 준비하는 금형	사내	3D 프린팅할 Flexipeg 구성 요소	내구성 있는 재료로 적층 제조. Protolabs(NL)의 ABS 프로토타이핑 수지를 사용하여 제조되었습니다.
실리콘 매트 측을 준비하는 금형	사내	3D 프린팅할 Flexipeg 구성 요소	내구성 있는 재료로 적층 제조.
인산염 완충 식염수	머 크	P4417-50탭
고인 인간 소변	-	-	중앙 대학 연구 윤리 위원회의 윤리적 승인에 따라 건강한 기증자로부터 수집됩니다.
유리관용 랙	사내	3D 프린팅할 Flexipeg 구성 요소	내구성 있는 재료로 적층 제조.
실리콘(PDMS)	MB 유리 섬유	GP3481-F	Polycraft 범용 RTV 응축 경화 금형 제작 실리콘 고무.
페그 뚜껑에 맞는 탑	사내	3D 프린팅할 Flexipeg 구성 요소	고온 안정 수지를 사용한 적층 제조.
폴리 카테터	그레이트 베어 헬스케어 UK Ltd		14채널, 100% 실리콘