염화세슘 기반의 게놈 함유 아데노바이러스 벡터 정제

초록

출처: Ehrke-Schulz, E., 등. 인간 아데노바이러스 5형 기반 고용량 아데노바이러스 벡터의 클로닝 및 대량 생산. J. Vis. Exp. (2016). 이 영상은 염화세슘 밀도 구배 초원심분리를 이용한 고용량 아데노바이러스 벡터의 정제 과정을 보여주며, 이를 통해 유전자 전달, 벡터 특성 분석 및 전임상 치료 연구에 적용 가능한 게놈 함유 비리온을 분리할 수 있습니다. Ehrke-Schulz, E., 외 등인간 아데노바이러스 5형 기반 고용량 아데노바이러스 벡터의 클로닝 및 대량 생산. J. Vis. Exp. (2016)

본 영상에서는 세슘 클로라이드 밀도 구배 초원심분리를 이용한 고용량 아데노바이러스 벡터의 정제 방법을 설명하며, 이를 통해 유전자 전달, 벡터 특성 분석 및 전임상 치료 연구에 활용 가능한 게놈 함유 비리온을 분리하는 과정을 보여줍니다.

프로토콜

1. HCAdV(고용량 아데노바이러스 벡터)의 정제 및 투석
   1. 세슘 클로라이드(CsCl) 밀도 구배를 위한 바이러스 용해물을 준비하려면, 세포-바이러스 현탁액을 액체 질소에 급속 냉동시킨 후 워터배스에서 다음 온도로 해동하십시오. 37 °C 4배.
   2. 바이러스 용해물을 실온(RT)에서 500 x g로 8분간 원심분리하고, HCAdV(고용량 아데노바이러스 벡터)가 포함된 상층액을 수집한다.
   3. 초원심분리를 위해 다음과 같이 CsCl 용액을 준비하십시오. 37.5g(1.5 g/cm³의 경우)을 측정하여³), 33.5 g (1.35 g/cm³ 기준)³), 그리고 31.25 g (1.25 g/cm³의 경우)³)의 CsCl 분말을 각각 넣고, dH2O로 채웁니다.₂0~25 ml.
      1. 용액이 투명해질 때까지 교반한 후, 용액을 멸균 여과한다. 마지막으로 각 용액에서 1ml를 취해 정밀 저울로 무게를 측정하여 밀도가 정확한지 확인한다. 1ml의 무게는 각각 1.5g, 1.35g, 1.25g이어야 한다.
      2. 밀도가 너무 높을 경우, 소량씩 단계적으로 첨가하여 이를 조정하십시오(µl)의 멸균 증류수(dH2O)₂O. dH2O 추가 후₂밀도를 다시 측정하십시오. 필요한 경우 dH2O를 더 추가하십시오.₂O.
      3. 밀도가 정확해질 때까지 이 절차를 반복하십시오. 밀도가 너무 낮은 경우, 소량의 CsCl 분말을 추가하여 조정하십시오. 다시 멸균 여과한 후 밀도를 확인하십시오. 밀도가 너무 높은 경우, dH2O를 추가하여 조정하십시오.₂이전에 설명한 대로 진행하십시오. 밀도가 여전히 너무 낮으면 CsCl을 더 추가하고, 다시 멸균 여과한 후 밀도를 확인하십시오. 밀도가 적절해질 때까지 이 과정을 반복하십시오.
   4. 6개의 투명한 초원심분리관에 CsCl 단계 구배를 준비합니다. 다음 순서에 따라 CsCl 용액을 투명한 관에 조심스럽고 천천히 피펫팅합니다: 1.5 g/cm³ 농도의 CsCl 용액 0.5 ml³ CsCl 용액, 1.35 g/cm³ 3 ml³ CsCl 용액 및 1.25 g/cm³의 3.5 ml³ CsCl 용액 (그림 1C).
   5. 단계 1.2에서 얻은 맑은 벡터 상청액 약 4.5 ml를 1.25 g/cm³ 층 위에 층층이 쌓습니다.³ CsCl 층. 스윙 아웃 로터(SW-41)가 장착된 초원심분리기를 사용하여 기울기 층을 다음 조건으로 원심분리한다. 12 °C HCAdV 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 빈 입자 및 세포 잔해로부터 분리하기 위해, 저속 가속 및 감속 조건에서 226,000 x g (35,000 rpm)로 최소 2시간 동안 원심분리한다.
      주의: 최적의 조건에서 튜브 상단에 세포 잔해(cell debris)가 확산된 띠 형태로 형성되었습니다. 그 아래로 두 개의 흰색 띠가 관찰됩니다. 위쪽 띠는 빈 입자(empty particles)를 포함하고 있으며, 아래쪽 띠는 HCAdV에 해당합니다.그림 1C 및 2A).
   6. 세포 잔해와 빈 입자 층을 조심스럽게 제거하고, 각 튜브의 하단 밴드에서 1 ml씩 수집하여 깨끗한 피펫 팁을 이용해 멸균된 50 ml 튜브로 바이러스를 옮깁니다. 여기에 1.35 g/cm³의 용액을 최대 24 ml까지 첨가합니다.³ 수집된 바이러스 입자에 CsCl 용액을 첨가하고 조심스럽게 혼합한다.
   7. 원심분리관에 1.35 g/cm³의 용액을 채웁니다.³ CsCl-바이러스 용액을 상층에 얹고, 226,000 x g (35,000 rpm)에서 하룻밤 동안(18-20시간) 원심분리한다. 12 °C 느린 가속 및 감속 설정의 스윙아웃 로터(SW-41)가 장착된 초원심분리기를 사용하여.
   8. 두드러진 하단 밴드에 존재하는 HCAdV를 수집하십시오. 상단 밴드에는 빈 입자가 포함되어 있을 가능성이 있으므로, 피펫을 사용하여 위쪽 층을 제거하십시오(참조 그림 1C 및 2B). 그런 다음, 피펫을 사용하여 아래쪽 밴드를 제거합니다.
   9. 수집된 바이러스 입자를 완충액 교체를 위해 투석하십시오.
      1. 분자량 컷오프(MWCO) 50,000인 투석 튜브를 약 8cm 길이로 잘라 멸균 증류수(dH2O)로 세척한다.₂이 과정을 3회 반복합니다. 그런 다음 투석 튜브의 한쪽 끝을 플라스틱 클램프로 밀봉하고, 1ml 피펫을 사용하여 단계 5.8에서 수집한 바이러스를 튜브 안으로 옮깁니다. 튜브 내부에 기포가 생기지 않도록 주의하며, 반대쪽 끝 또한 플라스틱 클램프 투석 밀봉 장치로 닫습니다.
      2. 1L의 투석 완충액(10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10% 글리세롤, 1 mM MgCl2)에서 투석한다.₂ (염화마그네슘)를 탈이온수(H₂O)에₂O) 2시간 동안 다음 온도에서 4 °C 천천히 교반하며 반응시킨다. 투석 버퍼를 2 L의 투석 버퍼로 교체하고, 다음의 조건에서 밤새(O/N) 투석한다. 4 °C 천천히 저어주며 혼합합니다. 또는 sucrose 완충액(140 mM NaCl (염화나트륨), 5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (인산수소이나트륨, 1.5 mM KH₂PO₄ (인산이수소칼륨 및 730 mM 수크로스, pH 7.8).
      3. 1ml 피펫을 사용하여 단계 1.9.2에서 투석된 바이러스 입자를 수집하십시오. 원하는 소량(25-100 µl)하고 정제된 바이러스를 -에서 보관하십시오.80 °C.

결과

그림 1. pAdVFTC로부터 HCAdV(고용량 아데노바이러스 벡터) 게놈의 클로닝 과정 및 방출에 대한 대표 결과. (A) PI-SceI 및 I-CeuI 소화를 통한 pHM5로부터의 목적 유전자(GOI) 발현 카세트 방출. (B) 정제된 GOI 발현 카세트 및 PI-SceI와 I-CeuI로 각각 소화하여 탈인산화 및 정제한 pAdVFTC. (C) GOI 포함 및 미포함 pAdVFTC 클론의 분석적 HincII 소화. (D) NotI 소화를 통한 pAdVFTC-GOI로부터 GOI를 포함하는 HCAdV 게놈의 방출

그림 2. 염화세슘 처리 후의 대표적인 결과 (CsCl(염화세슘) 밀도 구배 원심분리. (A) 단계 구배 원심분리를 수행한 후(단계 1.5 참조); (B) 연속 구배 이후(단계 1.7 참조).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ultra Clear 초원심분리기 튜브	Beckmann Coulter	344059	밀도 구배 원심분리
초원심분리기	Beckmann Coulter		밀도 구배 원심분리
SW-41 로터	Beckmann Coulter		밀도 구배 원심분리
Spectrum Laboratories Spectrapor 막	VWR	132129	투석 튜브
즉시 사용 가능한 투석 카세트	Thermo	66383	투석
염화세슘	Carl Roth	8627.1	밀도 구배 원심분리
LB 배지	Carl Roth	X968.3	세균 성장 배지
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	투석 완충액/ 용해 완충액
글리세롤 99.5%	Carl Roth	3783.1	투석 완충액
MgCl₂₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	투석 완충액
NaCl	Carl Roth	3957.1	선택적 투석 완충액
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	선택적 투석 완충액
자당	Carl Roth	9286.1	선택적 투석 완충액
나트륨₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	선택적 투석 완충액
1.5 ml 튜브	sarstedt	72,730,005	바이러스 제제 -도 보관80 °C