설치류 심실 조직 내 바이러스 트랜스진 발현 참고: 표적 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스 또는 아데노 부속 바이러스(AAV)와 이에 대응하는 대조군 바이러스인 Ad-GFP(녹색 형광 단백질)(역가 1 x 10¹⁰ plaque-forming units [PFU]/mL) 또는 AAV9-GFP(역가 1 x 10¹³ genome copies [GC]/mL)(재료 표 참조)를 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 바이러스 주입 당일에 바이러스를 얼음 위에서 해동합니다. 표적 유전자를 발현하는 바이러스와 대조군 바이러스를 각각 30 G ½ 바늘이 장착된 두 개의 서로 다른 주사기(부피 = 50 µL)에 흡입하여 사용 전까지 얼음 위에 보관합니다. 참고: 주사기와 바늘 내의 기포는 반드시 주의 깊게 제거해야 합니다. 쥐(rat) 또는 생쥐(mouse)에 부프레노르핀을 투여하고(rat 0.05 mg/kg, mouse 0.1 mg/kg, 피하 주사), 1시간 후 3% 이소플루레인(isoflurane)을 사용하여 마취를 유도하며, 이후 절차 동안 이소플루레인을 2%로 유지합니다(100% 산소, 유량 0.5-1.0 L/min). 포셉으로 동물의 몸(예: 꼬리)을 가볍게 집어 보았을 때, 동물이 몸을 움직이지 않고 반응하지 않으면 적절히 마취된 것으로 확인합니다. 전기 가열 패드를 사용하여 체온을 37 °C로 유지합니다. 털 깎이 기기를 사용하여 가슴 부위의 털을 깎습니다. 참고: 전기 가열 패드 사용 시 열 분포가 불균일할 수 있으므로 주의해야 합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 동물을 앙와위(supine position)로 두고 전임상 영상 시스템(재료 표 참조)을 사용하여 동물의 심장을 단축 단면 방향으로 초음파 영상 촬영합니다. 참고: 다음 단계들은 멸균 환경을 제공하는 2등급 생물안전 작업대(level II biosafety cabinet) 내에서 수행됩니다. 안전한 바늘 취급을 포함한 표준 안전 절차가 적용됩니다. 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 세정제와 알코올을 번갈아 사용하여 동물의 왼쪽 하부 가슴 부위를 원형으로 세 번 소독합니다. 초음파 영상 유도 하에, 단계 1.1에서 준비한 바이러스가 들어있는 주사기의 30 G 1/2 바늘을 동물의 왼쪽 하부 가슴 측면을 통해 가슴 내부로 삽입합니다. 바늘 끝을 좌심실 전벽 자유벽(front free wall)으로 접근시켜 바이러스 10-15 μL를 천천히 주입합니다. 초음파 영상에서 바늘 끝 주변의 밝기가 증가하는 것을 통해 주입 성공 여부를 확인합니다. 참고: 심근 조직의 물리적 손상을 방지하기 위해 각 부위당 주입되는 바이러스의 양은 15 μL를 초과하지 않아야 합니다. 바늘을 심장에서 뺀 후, 좌심실의 다른 부위에 삽입하여 동일한 양의 바이러스를 두 번째와 세 번째로 주입합니다. 참고: 총 주입 횟수는 실험 설계에 따라 결정됩니다. 국소적인 트랜스진 발현이 필요한 경우 한 번의 주입만 필요하며, 더 확산된 트랜스진 발현이 필요한 경우 일반적으로 여러 부위(3~5곳)에 주입이 필요합니다. 주입이 완료되면 동물을 케이지로 돌려보냅니다. 동물이 복와위(sternal recumbency)를 유지할 수 있을 정도로 충분히 의식을 회복할 때까지 주의 깊게 관찰한 후 사육실로 옮깁니다. 이후 2일 동안 동물에게 염산 부프레노르핀을 투여합니다(mouse의 경우 일 2회 0.1 mg/kg, rat의 경우 일 2회 0.05 mg/kg, 피하 주사). 동물을 동물실(vivarium)로 복귀시키고 통증이나 괴로움의 이상 징후가 있는지 매일 관찰하며, 징후가 발견될 경우 기관 동물실험윤리위원회(Institutional animal care committee) 프로토콜에 따라 처치합니다. Lu, A., 외. 설치류 심장에서의 바이러스성 트랜스진 발현 및 심성 부정맥 위험 평가 J. Vis. Exp. (2022)
본 영상은 마우스 모델에서 초음파 유도 하에 재조합 바이러스 벡터를 심근 내로 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 심장에 표적 유전자를 전달하여 외래 유전자 발현이 심장 기능에 미치는 영향을 연구하는 것을 가능하게 합니다.
