1. 재세포화된 쥐 간의 형질도입 아데노 부속 바이러스(AAV 벡터) 유래 바이러스 벡터의 대량 생산 AAV 벡터의 생산, 정제 및 정량: 간략하게, 롤러 병(roller bottle)에서 AAV 벡터를 생산하고 이오딕사놀(iodixanol) 구배 원심분리를 통해 정제한다. PD10 겔 여과 컬럼을 이용한 여과로 잔류 이오딕사놀을 제거한다. 게놈 AAV DNA를 표준물질로 사용하여 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)으로 AAV 벡터 농도를 결정한다. 참고: 본 연구에 사용된 자가 상보적-가성형(self-complementary, pseudotyped) AAV2/6 벡터는 형질도입 효율을 입증하기 위한 리포터로 에메랄드 그린 형광 리포터 단백질(EmGFP)을, 내인성으로 발현되는 유전자(인간 cyclophilin B (hCycB), 그림 1)의 넉다운(knockdown)을 위한 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 발현 카세트를 인코딩했다. 혈청형 6의 가성형 scAAV 벡터가 충분한 양으로 준비되었는지 확인한다(간 모델당 2.7 x 10^13 AAV 벡터). 간 모델의 형질도입 인산완충생리식염수(PBS)를 해당 부피만큼 첨가하여 AAV 벡터 용액을 최종 농도 5 mL 내 2.7 x 10^13 벡터 게놈으로 조정한다. 캐뉼라에서 튜브를 제거하여 간을 배지 회로에서 분리한다. 5 mL 주사기를 문맥의 캐뉼라에 연결하고 AAV 벡터 용액 전량(5 mL)을 주입한다. 참고: 선택적으로 페놀 레드(5 µg/ml)를 첨가하여 AAV 벡터 용액이 간 전체에 분포되는 과정을 추적할 수 있다. 펌핑 없이 1시간 동안 배양한다. 유량을 1.25 ml/min(10분), 2.5 ml/min(20분), 3.75 ml/min(30분) 순으로 점진적으로 증가시킨다. 재세포화된 쥐 간을 6일 동안 배양한다. 2. 형질도입된 재세포화 쥐 간의 평가 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 및 면역조직화학 분석 메스로 각 간엽(lobe)에서 샘플(0.5 x 0.5 x 1.5-2 cm)을 채취한다. 샘플을 4% 파라포름알데히드(PFA) + 4% 수크로스 용액에 넣고 4 °C에서 1.5시간 동안 배양한다. (주의: PFA는 독성 및 발암성 물질이다. 항상 흄 후드 내에서 PFA를 취급하고 적절한 보호복을 착용한다.) PBS로 3회 세척(세척 단계당 1분)하고 8% 수크로스에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양한다. 고정액을 플라스틱 냉동몰드(cryomold)에 붓고, 기포가 생기지 않도록 샘플을 고정액에 넣는다. 샘플이 충분히 덮일 때까지 고정액을 추가한다. 임베딩된 샘플은 추후 사용 시까지 -80 °C에 보관한다. 크라이오톰(cryotome)을 사용하여 동결 절편(10 µm)을 제작한다. 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 재세포화를 평가한다. 목적 유전자(여기서는 EmGFP)에 대한 면역조직화학 염색으로 형질도입 효율을 평가한다. 힐러, T. 외. 인간 간세포암 세포주 HepG2로 재세포화된 3차원 간 모델에서의 바이러스 벡터 연구 J. Vis. Exp. (2016)
이 비디오에서는 재세포화된 쥐 간 모델에서 바이러스 유전자 전달을 평가하기 위한 면역조직화학 염색 방법을 보여줍니다. 항체 검출 및 핵 염색과의 공동 국소화를 통해 확인된 리포터 발현은 세포 내 바이러스 형질전환이 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다.
