안정적 형질도입 세포주 제작 12-웰 플레이트의 웰당 50,0개의 HCT16 대장암 세포와 MDA-MB-231 유방암 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에 파종한다. 세포의 합류도가 60-70%가 될 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양한다. 세포를 인산완충생리식염수(PBS)로 세척하고, 암세포에 바이러스 함유 배지 1 mL를 첨가한 후 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양한다. 대조군으로는 암세포가 들어있는 2개의 웰에 10% FBS와 1% Pen/Strep이 첨가된 신선한 DMEM 배지 1 mL를 첨가한다. 흡입법을 이용하여 바이러스 함유 배지를 조심스럽게 제거한다. 세포를 PBS로 세척하고, 10%(v/v) 테트라사이클린 무첨가(Tet-free) FBS와 1% Pen/Strep이 포함된 DMEM으로 배지를 교체한다. 72시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 바이러스 형질도입 세포의 선택을 위해 10% Tet-free FBS, 1% Pen/Strep 및 1 µg/mL 퓨로마이신이 포함된 DMEM으로 배지를 교체한다. 사용하는 세포주에 따라, 형질도입되지 않은 세포에서 퓨로마이신 농도 범위(0.1, 0.5, 1, 2, 5 µg/mL)를 테스트하여 3일간의 배양 후 대조군 세포가 생존하지 않는 최저 농도를 선택함으로써 최적의 선택을 위한 퓨로마이신 농도를 조정한다. 퓨로마이신이 포함된 상태에서 3-14일 동안 세포를 배양하여 바이러스 형질도입 세포를 선택한다. 대조군으로는 형질도입되지 않은 세포가 들어있는 2개의 추가 웰을 준비하며, 하나는 퓨로마이신 함유 배지를, 다른 하나는 퓨로마이신이 없는 배지를 사용한다. 대조군 웰과 비교하여 바이러스 형질도입 세포 웰에서 퓨로마이신에 의한 세포의 부분적 사멸을 관찰한다. 참고: 형질도입되지 않은 세포는 퓨로마이신 존재 하에서 성장하지 않는다. 퓨로마이신 내성을 가진 HCT16 대장암 세포와 MDA-MB-231 유방암 세포에서 조건부 넉다운(KD) 효율을 검증한다. 참고: 독시사이클린의 유효 농도는 사용하는 세포주에 따라 다르므로 적정(일반적으로 10 ng/mL에서 2 µg/mL까지)해야 한다. 세포에 독성을 나타내지 않으면서 표적 단백질의 발현을 억제하는 데 효과적인 독시사이클린 농도를 결정한다. 본 프로토콜에서는 인비트로(in vitro)에서 1 µg/mL가 성공적으로 사용되었다. 0.1, 1, 2 µg/mL 독시사이클린의 존재 및 부재 하에서 세포를 72시간 동안 배양한다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 세포 용해물 내 억제된 단백질(여기서는 플라스미노겐 활성제 억제 1(PAI-1))의 발현 수준을 확인한다. 단쇄 헤어핀 RNA(shRNA)를 조건부로 발현하는 HCT116 및 MDA-MB-231 세포를 스크램블 대조군 세포와 비교한다. Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. 종양 미세환경으로의 단핵구/대식세포 모집 연구를 위한 암 세포주 내 유전자 발현의 조건부 넉다운. J. Vis. Exp. (2017)
이 영상에서는 Tet-유도성 렌티바이러스 shRNA 시스템을 이용하여 조건부 넉다운 암 세포주를 생성하는 방법을 보여줍니다. 바이러스 형질도입, 항생제 선택 및 doxycycline-유도 유전자 억제 단계를 상세히 설명합니다.
