단계적 수크로오스 원심분리를 이용한 바이러스 농축 현탁액 제조

초록

출처: Vijayraghavan, S. 및 Kantor, B. 분열 세포 내 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃을 위한 인테그레이스 결핍 렌티바이러스 벡터 생산 프로토콜. J. Vis. Exp., (2017)

이 비디오는 세포 배양 상층액으로부터 바이러스 입자를 정제하고 농축하기 위해 수크로스 기울기(sucrose gradient)와 수크로스 쿠션(sucrose cushion)을 이용한 2단계 초원심분리법을 보여줍니다. 이 절차는 부력 밀도에 기반한 분리를 가능하게 하여, 후속 응용 단계에 적합한 온전한 바이러스를 회수할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 초원심분리를 이용한 바이러스 입자 농축

참고: 본 연구에서는 설탕 농도 구배 단계와 설탕 쿠션 단계의 두 단계로 구성된 이중 설탕 정제 방법을 이용합니다(그림 1).

1. 자당 밀도 구배를 형성하기 위해 원추형 초원심분리 튜브에 다음 순서대로 용액을 채웁니다: 0.5 mL 70% sucrose (1x phosphate-buffered saline [PBS]에 용해), 0.5 mL 60% sucrose (DMEM에 용해), 1 mL 30% sucrose (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]에 용해), 그리고 2 mL 20% sucrose (1x PBS에 용해).
2. 바이러스가 포함된 상층액을 구배 층 위에 조심스럽게 추가합니다. 15 cm 플레이트 4개에서 얻은 상층액의 총 부피는 100 mL이므로, 바이러스 상층액 전체 부피를 처리하기 위해 회전당 6개의 초원심분리 튜브를 사용합니다.
   1. 이 단계에 사용되는 각 초원심분리 튜브의 최대 용량은 30 mL(자당 부피 포함)입니다. 액체가 넘치는 것을 방지하기 위해 최소 10%의 헤드스페이스를 남기고 바이러스 상층액을 튜브에 균등하게 분배합니다.
   2. 실험당 15 cm 플레이트를 4개보다 많이 사용하는 경우, 모은 바이러스 상층액의 최종 부피가 6개의 초원심분리 튜브에 쉽게 들어갈 수 있도록 플레이트당 배양 부피를 ~20 - 22 mL로 조정합니다.
   3. 초원심분리 튜브를 전체 용량의 최소 4분의 3까지 채워야 합니다. 그렇지 않으면 원심분리 중에 튜브가 파손되어 샘플 손실 및 장비 손상이 발생할 수 있습니다.
3. 1x PBS로 튜브의 균형을 맞추고 샘플을 17 °C에서 70,000 x g로 2시간 동안 원심분리합니다.
   참고: 가속 중에 자당 층이 흐트러지는 것을 방지하려면, 초원심분리기의 설정을 통해 회전 시작 후 처음 3분 동안 로터가 200 rpm까지 천천히 가속되도록 합니다. 마찬가지로, 회전 종료 시 3분에 걸쳐 로터가 200 rpm에서 0 rpm으로 천천히 감속되도록 설정합니다.
4. 30 - 60% 자당 분획을 깨끗한 튜브에 조심스럽게 수집합니다(그림 1). 모은 분획에 차가운 1x PBS를 추가하여 부피를 100 mL로 맞춘 후, 피펫팅을 여러 번 반복하여 혼합합니다.
5. 바이러스 준비물을 자당 쿠션 위에 조심스럽게 층을 쌓아 자당 쿠션 단계로 진행합니다. 이를 위해 튜브에 20% sucrose (1x PBS 내) 4 mL를 넣은 다음, 튜브당 ~20 - 25 mL의 바이러스 용액을 추가합니다. 튜브가 4분의 3 미만으로 채워진 경우, 멸균된 1x PBS로 채워 부피를 맞춥니다.
6. 이전과 마찬가지로 샘플의 균형을 조심스럽게 맞춘 후 17 °C에서 70,000 x g로 2시간 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 튜브를 종이 타월 위에 거꾸로 세워 남은 액체가 빠지도록 합니다.
7. 펠렛에서 모든 액체를 제거하기 위해 남은 방울들을 흡입합니다. 이 단계에서 바이러스가 포함된 펠렛은 작은 반투명 점으로 겨우 보일 정도여야 합니다.
8. 첫 번째 튜브에 70 µL의 1x PBS를 추가하고 현탁액을 철저히 피펫팅하여 펠렛을 재현탁한 다음, 해당 현탁액을 다음 튜브로 옮겨 이전과 동일하게 혼합하는 과정을 모든 펠렛이 재현탁될 때까지 반복합니다.
9. 차가운 1x PBS 50 µL를 추가로 넣어 튜브를 헹구고 이전과 같이 혼합합니다. 최종 현탁액의 합산 부피가 ~120 µL이며 약간 우유빛을 띠는지 확인합니다. 탁한 현탁액은 탁상용 마이크로 원심분리기에서 10,000 x g로 30초 동안 원심분리하여 투명하게 만듭니다.
10. 상층액을 새로운 마이크로 튜브로 옮기고, 10 µL씩 분주하여 -80 °C에 보관합니다.
    참고: 렌티바이러스 샘플의 반복적인 동결-해동 사이클을 피하십시오. 원심분리가 필요한 경우를 제외하고, 나머지 단계는 적절한 생물안전 조치를 취하여 조직 배양 후드 또는 지정된 조직 배양실에서 수행해야 합니다.

결과

그림 1: 이중 자당 농도 구배 프로토콜을 이용한 바이러스 입자 농축. 상층액(SN)에서 수집한 바이러스 입자를 자당 농도 구배에 로딩합니다. 농도 구배를 형성하기 위해 70%, 60%, 30% 및 20% 자당 용액을 사용합니다. 원심분리 후, 30-60% 자당 분획에서 수집된 입자를 20% 자당 쿠션에 추가로 로딩하여 침전시킵니다. 정제된 바이러스 입자가 포함된 최종 펠렛을 1x PBS에 재현탁하여 사용합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비
Optima XPN-80 초원심분리기	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R 탁상형 원심분리기	Beckman Coulter	369434
원추형 바닥 초원심분리 튜브	Seton Scientific	5067
원추형 튜브 어댑터	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti 스윙 버킷 로터	Beckman Coulter	369650
50mL 원추형 원심분리 튜브	Corning	430291
조직 배양용 피펫, 25 mL	Corning	4489