바이러스 역가 추정 - p24(인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1 p24 캡시드 단백질) 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA) 참고: 본 분석은 HIV-1 p24 항원 캡처 분석 키트(재료 표 참조)의 NIH AIDS 백신 프로그램 지침에 따라 고결합 96-웰 플레이트를 사용하여 수행하며, 일부 수정 사항이 적용되었습니다. 다음 날, 냉각된 PBS 내 0.05% Tween 20(PBS-T 용액) 20 µL로 웰을 3회 세척합니다. 1x PBS에서 1:150으로 희석한 단클론 항-p24 항체 10 µL를 플레이트에 코팅하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 비특이적 결합을 제거하기 위해 PBS 내 1% BSA 20 µL로 플레이트를 블로킹합니다. 냉각된 PBS 내 0.05% Tween 20(PBS-T 용액) 20 µL로 최소 1시간 동안 실온에서 3회 세척합니다. 시료 준비: 농축된 벡터 제제의 경우, 시료 1 µL에 dd-H2O 89 µL와 Triton X-10 10 µL(최종 농도 10%)를 첨가하여 10배 희석합니다. 비농축 제제의 경우, 시료 10 µL에 dd-H2O 80 µL와 Triton X-10 10 µL(최종 농도 10%)를 첨가하여 10배 희석한 시료를 준비합니다. 참고: 이 단계에서 시료를 -20 °C에 보관하면 장기간 보관 후 나중에 사용할 수 있습니다. 시작 농도를 5 ng/mL로 하여 2배 연속 희석을 적용해 HIV-1 표준물을 준비합니다. 농축 시료(1:10 사전 희석 스톡)를 0.2% Tween 20 및 1% BSA가 첨가된 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640 배지)에서 희석하여 1:10,0, 1:50,0 및 1:250,00 희석액을 만듭니다. 비농축 시료(1:10 사전 희석 스톡)를 0.2% Tween 20 및 1% BSA가 첨가된 RPMI 1640에서 희석하여 1:50, 1:250 및 1:12,500 희석액을 만듭니다. 시료를 플레이트에 3반복으로 분주하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 웰을 6회 세척하고 RPMI 1640, 10% FBS, 0.25% BSA 및 2% 정상 생쥐 혈청(NMS)에서 1:100으로 희석한 다클론 토끼 항-p24 항체 10 µL와 함께 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 위와 동일하게 6회 세척하고, 5% 정상 염소 혈청, 2% NMS, 0.25% BSA 및 0.01% Tween 20이 첨가된 RPMI 1640에서 1:10,00으로 희석한 염소 항-토끼 호르몬 퍼옥시다제 IgG와 함께 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 위와 동일하게 플레이트를 세척하고 TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) 퍼옥시다제 기질과 함께 실온에서 15분 동안 배양합니다. 1 N HCl 10 µL를 첨가하여 반응을 정지시킵니다. 흡광 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 시료의 흡광도를 측정합니다. Vijayraghavan, S., 외. 분열 세포 내 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃을 위한 인테그레이즈 결핍 렌티바이러스 벡터 제작 프로토콜. J. Vis. Exp. (2017).
이 영상에서는 렌티바이러스 벡터의 바이러스 역가를 측정하기 위한 p24 ELISA 사용법을 보여줍니다. 이 분석법은 바이러스 입자를 용해시켜 p24를 방출시키고, 이를 특이적 항체로 포획한 후, 측정 가능한 색 변화를 유도하는 퍼옥시다제 결합 시스템으로 검출하는 과정으로 이루어집니다. 샘플의 흡광도 값을 표준 곡선과 비교하여 바이러스 역가를 정량화합니다.
