재조합 아데노 관련 바이러스 9(rAAV9) 플라스미드를 이용한 HEK293 세포 형질전환 1 µg/µl의 선형 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 준비한다. PEI 분말을 70-80 °C로 가열한 엔도톡신 제거 dH2O에 녹인다. 실온(RT)으로 냉각시킨 후, 1 M HCl을 사용하여 용액의 pH를 7.0으로 중화한다. 용액을 여과 멸균(0.2 µm)한다. 1 µg/µl PEI 스톡 용액을 분주(튜브당 1,40 µl)하여 -20 °C에 보관한다. 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 HEK293 세포를 배양한다. 세포를 5 ± 0.5% 이산화탄소(CO2) 농도의 37 °C 인큐베이터에서 배양한다. 0일 차에, 형질전환 18-20시간 전에 90% 이상의 합류도(confluence)에 도달한 세포를 1:2로 희석하여 10개의 150-mm 디쉬에 분주한다. 참고: 1일 차에 세포의 합류도가 90%에 도달해야 한다. 1일 차에, PEI를 사용하여 rAAV9 플라스미드(예: rAAV9.cTNT::GFP 또는 rAAV6.U6::shRNA 제작물), Ad-Helper 플라스미드 및 AAV-Rep/Cap 플라스미드를 HEK293 세포에 형질전환한다. 합류도가 90%인 세포 10개 디쉬의 경우, AAV-Rep/Cap 플라스미드 70 µg, rAAV9 플라스미드 70 µg, Ad-Helper 플라스미드 20 µg을 50-ml 원심분리 튜브에 혼합한다. 세포의 합류도가 이보다 낮을 경우, DNA 양을 비례적으로 조절한다. 예를 들어, 세포 합류도가 75%인 경우 DNA 양을 비례적으로 줄여(단계 1.4.1에 제시된 양의 75/90배), AAV-Rep/Cap 플라스미드 70 x 75/90 = 58.3 µg, rAAV9 플라스미드 70 x 75/90 = 58.3 µg, Ad-Helper 플라스미드 20 x 75/90 = 16.7 µg을 50-ml 원심분리 튜브에 혼합한다. 50-ml 튜브에 실온의 DMEM(FBS 제외) 49 ml를 넣고 잘 섞는다. PEI:DNA 비율(v/w)이 4:1이 되도록 PEI 용액 1,360 µl를 첨가한다. 잘 섞은 후 실온에서 15-30분 동안 배양한다. 단계 1.4.4에서 준비한 혼합액 5 ml를 각 150-mm 디쉬에 첨가한다(10개의 150-mm 디쉬에 총 50 ml의 혼합액 사용). 5 ± 0.5% CO2 농도의 37 °C 인큐베이터에서 세포를 60-72시간 동안 배양한다. Ding, J., 외.마우스 심장에서의 유전자 과발현 또는 넉다운을 위한 rAAV9 제작. J. Vis. Exp. (2016)
이 비디오에서는 포유류 세포의 플라스미드 transfection을 통한 재조합 아데노 관련 바이러스 입자의 생산 과정을 보여줍니다. 여기에서는 핵 내에서 바이러스 게놈 복제와 캡시드 조립을 유도하는 Rep, Cap 및 helper 단백질의 협력적 발현을 강조합니다.
