형질전환된 인간 신장 세포로부터의 재조합 바이러스 입자 정제

출처: Ding, J. et. al., 생쥐 심장에서의 유전자 과발현 또는 녹다운을 위한 rAAV9 제조. J. Vis. Exp. (2016)

본 영상에서는 형질전환된 인간 신장 세포로부터 재조합 바이러스 입자를 정제하는 과정을 보여줍니다. 바이러스는 동결-융해 용해법으로 방출되며, 블록 공중합체 보조 여과법을 이용한 아이오딕사놀 밀도 구배 원심분리를 통해 정제됩니다.

재조합 아데노 부속 바이러스 9(rAAV9) 플라스미드를 이용한 HEK293 세포의 형질전환
1. 준비하십시오 1 µg/µl 선형 폴리에틸렌이민(PEI) 용액. PEI 분말을 엔도톡신 제거 dH2O에 녹인다.₂70°C까지 가열된 O80 °C실온(RT)까지 냉각한 후, 1 M 염산(HCl)을 사용하여 용액을 pH 7.0으로 중화합니다. 여과 멸균합니다(0.22 µm) 용액. 다음을 소분하십시오. 1 µg/µl PEI 스톡 용액 (1,400 µl/tube) 및 해당 용액을 -에서 보관하십시오.20 °C.
2. 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 HEK293 세포를 배양합니다. 세포를 다음에서 배양합니다. 37 °C 5% $\text{CO}_2$ 배양기 ± 0.5% 이산화탄소 (CO2)₂).
3. 0일 차에, 형질전환 18~20시간 전에 세포 분할을 통해 HEK293 세포를 10개의 150mm 디시에 접종한다. > 1:2 희석액 내의 90% 합류된 세포.
  참고: 1일 차에 세포의 합류도가 90%에 도달해야 합니다.
4. 1일 차에 PEI를 사용하여 HEK293 세포에 rAAV9 플라스미드(예: rAAV9.cTNT::GFP 또는 rAAV6.U6::shRNA 컨스트럭트), Ad-Helper 플라스미드 및 AAV-Rep/Cap 플라스미드를 형질전환합니다.
  1. 90% 합류도(confluence)에 도달한 10개의 세포 배양 접시의 경우, 다음을 혼합하십시오. 70 µg AAV-Rep/Cap 플라스미드의 70 µg pfrAAV9 플라스미드 및 200 µg 50mL 원심분리 튜브에 담긴 Ad-helper 플라스미드.
  2. 세포의 합류도(confluency)가 더 낮은 경우, DNA 양을 비례하게 조정하십시오. 예를 들어, 세포 합류도가 75%인 경우 DNA 양을 비례하여 줄이십시오(단계 2.4.1에 표시된 양의 75/90배): 70 x 75/90 = 를 혼합합니다. 58.3 µg AAV-Rep/Cap 플라스미드의, 70 x 75/90 = 58.3 µg rAAV9 플라스미드, 그리고 20 x 75/90 = 166.7 µg 50ml 원심분리 튜브에 담긴 Ad-Helper 플라스미드의
  3. 50ml 튜브에 실온의 DMEM(FBS 미포함) 49ml를 넣고 잘 섞어줍니다.
  4. 첨가하십시오 1,360 µl PEI 용액을 첨가하여 PEI:DNA 비율(v/w)을 4:1로 맞춘다. 잘 혼합한다. 실온에서 15~30분 동안 배양한다.
  5. 단계 1.4.4에서 준비한 혼합물 5ml를 각 150mm 디시에 추가합니다(150mm 디시 10개당 혼합물 50ml).
5. 세포를 다음의 조건에서 배양합니다. 37 °C 5% $\text{CO}_2$ 배양기 ±0.5% CO₂ 60-72시간 동안.
형질전환된 HEK293 세포의 수확 및 rAAV9 벡터의 정제
1. 트랜스펙션 60-72시간 후에 세포를 수확합니다. 배양액을 이용하여 파이펫팅으로 접시 내의 세포를 떼어내어 현탁합니다. 모든 세포 현탁액을 멸균된 50ml 튜브로 옮깁니다.
2. 세포를 50 x g에서 5분 동안 원심분리한다. 각 튜브의 세포 펠렛을 5 ml의 인산완충생리식염수(PBS)로 재현탁하고, 모든 세포 현탁액을 하나의 50 ml 튜브에 모은다.
3. 세포를 50 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 이 단계에서 세포 펠렛을 -80 °C 또는 단계 2.4-2.15에 기술된 대로 펠릿으로부터 AAV를 즉시 정제합니다.
4. 용해 완충액을 준비합니다: 150 mM 염화나트륨(NaCl) 및 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane Hydrochloride(Tris-HCl, pH 8.0). 여과 멸균합니다(0.22 µM). 버퍼를 다음 온도에서 보관하십시오. 4 °C.
5. 침전물을 10 ml의 용해 버퍼(lysis buffer)로 재현탁하십시오.
6. 용해물을 -°C에서 냉동하십시오.80 °C 또는 드라이아이스/에탄올 배스(bath)에서 보관한 후, 다음 온도에서 해동하십시오. 37 °C1분 동안 볼텍싱합니다. 용해물을 3회 동결 및 해동합니다.
7. 염화마그네슘(MgCl2)을 추가합니다.₂) 용액을 해동된 용해물에 첨가합니다(MgCl의 최종 농도가 되도록 합니다.₂용해물 내 농도가 1 mM이 되도록 합니다). 뉴클레아제(nuclease)를 최종 농도가 250 U/ml가 되도록 첨가합니다. 다음 온도에서 배양합니다. 37 °C DNA/단백질 응집체를 용해시키기 위해 15분 동안 둡니다.
  참고: 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 처리 후에도 DNA/단백질 응집물이 용해되지 않는 경우, 용해물을 20회 dounce 균질화하십시오.
8. 샘플을 4,800 x g에서 20분 동안 원심분리하십시오. 4 °C상층액을 수집한다.
9. 그동안 Iodixanol 밀도 구배 용액을 준비하십시오.
  1. 10배 PBS 5ml와 1M MgCl₂ 0.05ml를 혼합하여 17% 밀도 구배 용액을 준비합니다.₂, 0.125 ml의 1 M 염화칼륨(KCl), 10 ml의 5 M NaCl 및 12.5 ml의 밀도 구배 배지를 추가합니다. $\text{H}_2\text{O}$를 사용하여 전체 부피를 50 ml로 맞춥니다.₂O.
  2. 10x PBS 5 ml과 1 M MgCl2 0.05 ml를 혼합하여 25% 용액을 준비하십시오.₂, 1 M KCl 0.125 ml, 밀도 구배 배지 20 ml, 그리고 0.5% (w/v) 페놀 레드(Phenol Red) 0.2 ml를 넣습니다. H2O를 사용하여 총 부피를 50 ml로 맞춥니다.₂O.
  3. 10x PBS 5ml와 1M MgCl2 0.05ml를 혼합하여 40% 용액을 준비하십시오.₂, 1 M KCl 0.125 ml 및 밀도 구배 배지 3.3 ml. H2O를 사용하여 총 부피를 50 ml로 맞춥니다.₂O.
  4. 1 M MgCl2 0.05 ml를 혼합하여 60% 용액을 준비하십시오.₂, 1 M KCl 0.125 ml, 밀도 구배 배지 50 ml, 그리고 0.5% (w/v) 페놀 레드(Phenol Red) 0.1 ml.
10. 바늘과 주사기를 사용하여 폴리프로필렌 튜브에 요딕사놀(Iodixanol) 농도 구배 용액을 바닥부터 17% 5ml, 25% 5ml, 40% 5ml, 60% 5ml 순으로 주입한다. 단계 3.8에서 얻은 모든 용해물(14-16ml)을 구배 상단에 적재한다. 하단부터 상단 순으로 나열된 구배 층은 60%, 40%, 25%, 17%이며, 그 위에 용해물 층이 놓인다. 튜브의 남은 공간을 용해 버퍼(lysis buffer)로 채운 후 코르크로 덮는다.
11. 185,0 x g에서 90분 동안 원심분리하십시오. 16 °C.
12. 주사기를 사용하여 바이러스 분획(40% 층)을 수집합니다. 21게이지 바늘을 40% 분획과 60% 분획의 경계면에 삽입하여 40% 층만을 흡입합니다.
  참고: 25% 층을 흡입하지 않도록 주의하십시오.
13. 바이러스 분획을 멸균된 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 PBS 용액(10% 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 스톡을 PBS로 1:10,0로 희석)과 섞어 최종 부피를 15 ml로 맞춥니다. 혼합물을 필터 튜브(분자량 컷오프 = 10 kD)에 넣습니다. 2,00 x g에서 30분 동안 원심분리합니다. 4 °C.
14. 바닥의 용액을 버립니다. 필터 튜브에 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 PBS 용액을 채워 총 부피를 15ml로 맞춥니다. 2,0 x g에서 20분 동안 원심분리합니다. 4 °C이 단계를 두 번 더 반복하십시오. 정제된 rAAV9 바이러스(필터 윗부분의 분획)를 수집하십시오.
15. 필터 튜브에 담긴 정제된 rAAV9를 1.7-mL 튜브로 옮깁니다. 정제된 rAAV9를 (10- 400 µl/tube(AAV의 부피와 역가에 따라 다름) 및 바이러스를 -에 보관하십시오.80 °C.
  참고: 반복적인 동결-해동을 피하십시오.

이름	회사	카탈로그 번호
선형 폴리에틸렌이민 (분자량 25,00)	Polysciences, Inc.	#23966-2
튜브, 폴리프로필렌, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (수량 56개)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
초순수 뉴클레아제	SIGMA	#E8263-25KU
밀도 구배 매질(Iodixanol)	SIGMA	#D156-250ML
Ultracel-10 막이 장착된 원심분리 여과 장치	EMD Millipore Corporation	#UFC9108
다음이 장착된 실험실 피펫팅 바늘 90° 평단면(blunt ends), 14게이지, 길이 6인치, 니켈 도금 허브	SIGMA	#CAD7942-12EA
Poloxamer 18 용액 (Pluronic® F-68 용액)	SIGMA	P56-10ML
프로테이나제 K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
원심분리기	Thermo Scientific	75004260
원심분리 시스템	Beckman Coulter	363118
초원심분리기	Beckman Coulter
DMEM 배지	Fisher Scientific	SH30243FS
태아 송아지 혈청	Atlanta Biologicals	S150
rAAV9 벡터	Penn Vector Core	P1967

형질전환된 인간 신장 세포로부터의 재조합 바이러스 입자 정제

이 논문에서

초록

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