내피세포(EC)의 E6 및 E7 파필로마바이러스 유전자 형질전환 참고: 일차 내피세포 배양에는 일반적으로 표준 조직 배양 플라스크를 사용합니다. 그러나 내피세포의 성장이 불충분한 경우에는 상용 배양 플라스크의 사용을 고려해야 합니다. 일차 인간 진피 미세혈관 또는 림프 내피세포를 T75 세포 배양 플라스크에서 약 50% 합류도(confluence)가 될 때까지 EC 성장 배지(EGM; EGM-2 BulletKit[태아 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 인간 섬유아세포 성장인자-B, 혈관 내피세포 성장인자, 인슐린 유사 성장인자-1, 아스코르브산, 인간 상피세포 성장인자, 항생제 및 헤파린 포함]가 보충된 EC 기초 배지[EBM] 포함)를 사용하여 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 배양합니다. 형질전환을 위해, PA317 LXSN 16E6E7 세포를 10% 태아 송아지 혈청과 항미생물제가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 내에서 T150 세포 배양 플라스크를 사용하여 약 90% 합류도가 될 때까지 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 배양합니다. 그 후 16 mL의 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. PA317 배지를 실온에서 300 × g로 5분간 원심분리하여 청징화합니다. 내피세포 배양액에서 EGM을 제거하고, 청징화된 PA317 배지 12 mL를 세포 위에 덮어 4시간 동안 배양합니다. 참고: 조건화 배지 16 mL를 300 × g로 5분간 원심분리하면 조밀한 펠렛이 형성되므로, 이후 12 mL의 청징 상층액을 조심스럽게 제거해도 펠렛이 흐트러지지 않습니다. 그러나 일차 내피세포 배양물로 PA317 LXSN 16E6E7 세포가 전이되는 것이 우려되는 경우(포장 세포주가 내피세포보다 빠르게 성장함), 전이 전에 조건화 상층액을 0.45 µm 필터로 여과할 수 있습니다. PA317 배지 6 mL를 신선한 EGM으로 교체하고 하룻밤 동안 배양합니다. 내피세포에 신선한 EGM 12 mL를 다시 공급하고 48시간 동안 더 배양합니다. 내피세포를 계대 배양하려면, 배지를 제거하고 양이온이 없는 인산완충식염수(PBS) 12 mL로 세척한 뒤, 상용 효소 해리 용액(예: TrypLE) 3 mL를 첨가하고 37 °C에서 3분간 배양합니다. 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮겨 실온에서 300 × g로 5분간 원심분리합니다. 생성된 세포 펠렛을 신선한 EGM에 재현탁하고, 플라스크당 최종 부피 12 mL의 EGM이 되도록 3개의 T75 플라스크에 균등하게 나눕니다. E6 및 E7이 형질전환된 내피세포를 선택하기 위해, 두 번의 계대 배양 동안 G418을 최종 농도 200 µg/mL로 첨가합니다. 이후 형질전환된 내피세포를 감염 실험을 위해 플레이팅하거나 액체 질소에 냉동 보관할 수 있습니다. McAllister, S. C., Hanson, R. S., 등. Kaposi Sarcoma Herpesvirus에 의한 세포 변형 연구를 위한 인 비트로 모델. J. Vis. Exp.(2017)
이 영상은 HPV16 E6/E7 온코진을 이용한 일차 내피세포의 레트로바이러스 형질전환 과정을 보여줍니다. 통합된 온코진은 p53 및 Rb 종양 억제 인자를 비활성화하여 세포 수명을 연장합니다. G418 선택 과정을 통해 형질전환된 세포를 농축함으로써 변형 연구에 적합한 불멸화된 내피세포 배양물을 얻을 수 있습니다.
