이 비디오에서는 바이러스에 감염된 세포 내의 바이러스 RNA를 시각화하기 위한 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 방법을 시연합니다. 또한 프로브 하이브리다이제이션, 신호 증폭 및 공초점 이미징에 포함되는 단계들을 설명합니다.
방법 논문
형광 인시튜 하이브리드법(FISH)을 이용한 숙주 세포 내 바이러스 RNA 분포 측정
76 조회수
⸱
2026년 8월 31일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 바이러스 RNA의 고정, 하이브리드화 및 시각화
- 배지와 과잉 세포를 제거한다. 본 프로토콜 전반에 걸쳐 용액을 제거할 때는 진공 흡입을 사용하고, 용액을 첨가할 때는 부드럽게 마이크로피펫팅을 수행한다.
참고: 유리 파스퇴르 피펫 위에 200 µL 마이크로피펫 팁을 배치하여 진공 강도를 낮출 수 있다. 오염을 방지하기 위해 세척 단계마다 마이크로피펫 팁을 교체한다. 세포가 마르는 것을 절대적으로 방지해야 하므로 각 세척 단계는 신속하게 수행해야 한다. - 즉시, 미리 냉각시킨 4% formaldehyde/PBS (인산염 완충 식염수)를 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 세포를 고정한다. 4 °C로 냉각시킨 200 µL 1x PBS로 세포를 3회 세척하고 실온 또는 얼음 위에서 5분 동안 배양한다.
- 미리 냉각시킨 0.5% Triton-X/PBS 200 µL를 사용하여 얼음 위에서 10분 동안, 또는 미리 냉각시킨 70% ethanol 750 µL를 사용하여 4 °C에서 최소 1시간(min)에서 최대 7일(max) 동안 고정된 세포를 투과화한다.
참고: 별도의 명시가 없는 한 본 프로토콜의 모든 세척은 동일한 방식으로 수행된다. 70% ethanol은 챔버와 슬라이드 사이의 접착제를 느슨하게 하여 추후 분리를 용이하게 하며, 프로토콜 진행 중 상당한 휴지 시간을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 증발을 줄이기 위해 챔버 슬라이드 주변에 파라핀 필름을 사용하고 약 8시간마다 각 챔버의 ethanol 수위를 확인한다. 또한 70% ethanol은 세포를 평평하게 만들어 더 선명한 이미지를 얻게 하는 반면, Triton-X는 세포를 탈수시키지 않으므로 세포의 크기를 변화시키지 않는다.
- 미리 냉각시킨 0.5% Triton-X/PBS 200 µL를 사용하여 얼음 위에서 10분 동안, 또는 미리 냉각시킨 70% ethanol 750 µL를 사용하여 4 °C에서 최소 1시간(min)에서 최대 7일(max) 동안 고정된 세포를 투과화한다.
- 슬라이드가 깨지지 않도록 챔버를 조심스럽게 제거한다.
참고: 제조사에서 제공한 새 제거 장치 또는 잔여 접착제가 거의 없는 장치를 사용하고, 슬라이드가 깨지는 것을 방지하기 위해 챔버를 부드럽게 떼어낸다. 투과화 시약으로 70% ethanol을 4시간 동안 사용하면 깨질 가능성이 크게 줄어든다. 슬라이드가 깨진 경우, 깨지지 않은 챔버에서 프로토콜을 계속 진행하며, 밀봉이 불완전한 슬라이드는 산화 속도가 빨라져 보관 수명이 단축됨에 유의한다. - 2x SSC (염화나트륨 구연산염)로 세포를 1회 세척한 다음, 50% formamide, 10% dextran sulfate, 2x SSC, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 500 µg/mL salmon sperm deoxyribonucleic acid (DNA), 125 µg/mL E. coli transfer RNA (tRNA), 1 mM vanadyl ribonucleoside complexes로 구성된 하이브리다이제이션 용액 45 µL를 도포한다. 습윤한 멸균 와이프를 넣은 150 mm Petri dish 형태의 습도 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양한다.
참고: 하이브리다이제이션 용액은 사용 최소 1시간 전에 신선하게 준비한다. 먼저 dextran sulfate를 물에 녹이고, 빈번하게 볼텍싱하며 37 °C 항온수조에서 배양한다. - 챔버당 35 µL의 하이브리다이제이션 용액에서 권장 농도인 25 µM를 달성하는 데 필요한 oligonucleotides의 양을 계산한다. 필요에 따라 anti-sense oligonucleotide의 농도를 조절한다. oligonucleotides에 증류수를 추가하여 변성 부피를 10 µL로 맞춘다.
참고: 라벨링 반응 후, oligonucleotides는 0.18 M potassium cacodylate, 23 mM Tris-HCl, 0.23 mg/mL BSA, 4.5 mM CoCl2, 18 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2.7 mM potassium phosphate, 6.8 mM KCl, 45 µM 2-Mercaptoethanol, 0.02% Triton X-100 및 2% glycerol가 포함된 퀀칭 용액에 보관된다. 이 농도는 충분히 높아서 물로 희석하면 표준 oligonucleotide 변성 버퍼인 1x TE (10 mM Tris-HCl 및 1 mM EDTA)에 가까운 농도로 변성 용액을 만들 수 있다. - digoxigenin (DIG)- 및/또는 Alexa Fluor 594-라벨링된 oligonucleotides를 95 °C에서 5분 동안 변성시킨다. 그런 다음 변성된 oligonucleotides에 대상 챔버당 35 µL의 신선한 하이브리다이제이션 용액을 추가한다. 이중 형광 in situ 하이브리다이제이션 (FISH)을 수행하는 경우, 두 세트의 anti-sense oligonucleotides를 함께 변성시키고 하이브리다이제이션할 수 있다.
- 전-하이브리다이제이션 용액을 제거한 다음, 라벨링된 oligonucleotides가 포함된 하이브리다이제이션 용액을 세포에 첨가한다. 형광체 라벨링된 oligonucleotides를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮고 습도 챔버 내 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한다.
참고: 배양 시간은 최소 10시간에서 최대 24시간 이내여야 한다. - 다음 날, 37 °C에서 2x SSC로 세포를 10분 동안 2회 세척하고, 이어서 25 °C에서 1x SSC로 10분 동안 2회 세척한다.
- 미리 냉각시킨 4% formaldehyde/1x PBS를 사용하여 얼음 위에서 10-15분 동안 세포를 고정한다. 그런 다음 PBS로 세포를 3회 세척하고, 미리 냉각시킨 70% ethanol로 1시간 동안 또는 4 °C에서 미리 냉각시킨 0.5% Triton-X/1x PBS로 10분 동안 투과화한다.
- 미리 냉각시킨 0.1% BSA/1x PBS 내의 1:200 anti-digoxigenin (DIG)–fluorescein isothiocyanate (FITC)와 함께 4 °C에서 1시간 동안 세포를 배양한다. 항체 용액을 제거하고 1x PBS로 3회 세척한다.
- 미리 냉각시킨 4% formaldehyde/1x PBS를 사용하여 4 °C에서 10-15분 동안 고정하고 1x PBS로 3회 세척한다.
- 미리 냉각시킨 0.5% Triton-X/1x PBS 내의 0.4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 함께 얼음 위에서 15분 동안 세포를 배양한 후 1x PBS로 3회 세척한다.
- 형광 비드(선택 사항)와 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드를 마운팅한다. 그런 다음 투명 매니큐어로 커버슬립을 슬라이드에 밀봉한다.
- 공초점 현미경을 사용하여 프로토콜 수행 후 1시간에서 1주일 이내에 630배 배율로 샘플 이미지를 수집한다. 매니큐어를 여러 번 덧칠하여 커버슬립을 밀봉하고 산화 속도를 낮추어 형광체의 수명을 연장한다.
참고: DAPI가 포함된 마운팅 매질은 사용하지 않는다. 이미지 수집 시, 추후 정량을 위해 각 이미지에 스케일 바를 포함한다. 형광 비드는 슬라이드와 샘플 준비물 간의 형광 강도 대조군 역할을 한다. 2차원 (2D) 정량을 위해 세포의 중앙 단면에서 이미지를 획득한다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Dextran sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | 분자생물학 등급 |
| DIG-oligonucleotide tailing kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2세대 |
| 8-챔버 슬라이드 | Nunc Lab Tek II | #154453 | 블루 씰(Blue seal)이 표면 장력을 높여주지만, 투명 겔로 분리된 제품도 사용 가능하다. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | 분자생물학 등급 |
| Vanadyl ribonucleoside complexes | NEB | S1402S |
