시간 경과에 따른 용원성 박테리아의 자발적 파지 유도 측정

초록

출처: Krishnamurthi, R., et al. 전사체 분석을 통한 온건성 박테리오파지가 라이소젠에 미치는 영향의 이해. J. Vis. Exp. (2024).

이 영상은 시간 경과에 따른 생존 박테리아 세포(CFU)와 감염성 파지 입자(PFU)를 정량화함으로써, 라이소제닉 Pseudomonas aeruginosa에서 일어나는 자발적 파지 유도의 시간적 수치화를 보여줍니다. 성장 과정 중 정해진 간격으로 샘플을 채취하고 콜로니 및 플라크 형성을 모두 분석함으로써, 자발적 유도가 최소가 되는 시점을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 용균성 간섭을 최소화하면서 후속 전사체 분석을 수행하기 위한 최적의 시간대를 식별할 수 있습니다.

프로토콜

1. 자발적 유도의 시간적 직접 계수 (그림 1)

1. 단일 콜로니를 5 mL의 LB (Luria–Bertani broth)에 접종하여 라이소젠 (예: LES (Liverpool Epidemic Strain (LES) bacteriophages) 파지를 보유한 P. aeruginosa PAO1 라이소젠)과 지표 숙주 (PAO1-Rif^R) (리팜피신 내성 Pseudomonas aeruginosa PAO1)의 하룻밤 배양 스타터 배양액을 준비하고, 37 °C에서 180 rpm으로 진탕 배양한다 (18–24 h).
2. 하룻밤 배양한 배양액을 100 mL의 LB에 1:100 비율로 접종하여 신선한 라이소젠 및 지표 숙주 배양액을 준비하고, 37 °C에서 진탕 배양 (180 rpm) 한다.
   1. Miles Misra 기법을 사용하여 OD₆₀₀과 생존 균수를 측정함으로써 라이소젠 성장을 모니터링한다. 이를 위해 접종 시점부터 8시간 동안 매시간 각 라이소젠 배양액에서 1 mL 샘플을 수집한다.
   2. 수집 직후 샘플 100 µL를 해당 배지 900 µL에 첨가하여 연속 희석한다. 최대 속도로 충분히 볼텍싱하고, 각 희석 단계마다 팁을 교체하며 10⁻¹에서 10⁻⁹까지 희석 시리즈를 수행한다.
   3. 필요한 희석액 10 µL를 LB 한천 배지에 3반복으로 스팟하고, 건조시킨 후 37 °C에서 18–24시간 동안 배양한다.

   4. 생존 박테리아 세포 수를 계산하려면 콜로니 수를 쉽게 셀 수 있는 희석 배수를 찾는다. 각 스팟의 콜로니 수를 세고 다음 공식을 사용한다:
       

      

      
      참고: 라이소젠 배양액이 성장함에 따라 자발적 유도에 의해 활성 파지 입자가 생성된다. 감염성 파지의 생성은 라이소젠 집단의 전사체가 이제 용균성 파지 복제 신호 및 그에 따른 숙주 세포 반응으로 인한 용균 복제 주기 관련 유전자 발현으로 오염되었음을 의미한다. 따라서 데이터 세트에서 (용균성 파지 전사체에 의해 생성되는) 배경 전사 노이즈를 최대한 제한하기 위해, 유리 감염성 파지 입자 대비 라이소젠 세포의 비율이 가장 높은 성장 단계를 식별하는 것이 중요하다.

3. 각 시간대별 샘플 내의 감염성 파지 입자 수를 측정하기 위해, 적절한 선택제 (PAO1 숙주의 MIC가 16 µg·mL⁻¹에 불과하므로 이 경우에는 50 µg·mL⁻¹ 리팜피신)가 존재하는 상태에서 멸균된 0.4% LB 세균학적 한천 (탑 아가) 5 mL에 대수 성장 중간기 지표 숙주 (OD600: 0.4–0.5; 이 경우 PAO1-Rif^R) 100 µL를 접종한다.
   1. 동일한 연속 희석액 (단계 1.2.2 참조) 10 µL를 접종된 탑 아가 층에 스팟하고, 건조시킨 후 37 °C에서 18–24시간 동안 배양한다.

   2. 감염성 파지 입자 수를 계산하려면 플라크 수를 쉽게 셀 수 있는 희석 배수를 찾는다. 각 스팟의 플라크 수를 센다.
       

      

   3. 이후의 실험 단계를 위해 CFU (콜로니 형성 단위)당 자발적 유도가 최소가 되는 시간/조건을 찾는다.

결과

그림 1: 동일 샘플로부터 라이소젠의 PFU 및 CFU를 측정하기 위한 실험 설계.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PAO1		6
LESB58		6
LES phages	Norfloxacin을 사용하여 LESB58로부터 유도 및 정제함.
Lysogeny Broth (LB)	Merck	1.10285.500
LB Agar	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Top Agar	물 100 mL에 Agar Agar 0.4 g + LB Broth 2.5 g 혼합; 오토클레이브 후 사용.	-
Rifampicin	Sigma (스톡: Methanol 내 50 mg/mL- 잘 혼합한 후 0.22µm 필터로 멸균하여 -20°C에서 보관하며 사용)	R3501