1. RNA(리보핵산) 추출을 위한 비유도 및 유도 용원성 배양액 준비 1.1. 용원성 균주의 단일 콜로니를 5 mL의 LB 배지에 접종하여 새로운 하룻밤 배양액을 준비하고, 37 °C에서 18~24시간 동안 진탕 배양(180 rpm)한다. 1.2. 하룻밤 배양한 배양액을 1:100 비율로 8개의 250 mL 플라스크에 나누어 80 mL의 LB(Lysogeny broth) 배지에서 계대 배양한다. 1.3. 첫 번째 플라스크에는 “비유도(un-induced)”라고 표시하고, 나머지 플라스크에는 “유도(induced)” 표시와 함께 각 샘플을 수확해야 하는 시점(예: “유도 t = 0”, “유도 t = 10분”, “유도 t = 20분” 등)을 기입한다(그림 1). 1.4. 배양 90분 후, OD(광학 밀도) 600이 0.1~0.2 사이일 때, 또는 최소 자발적 유도 시점(토론 참조)에 비유도 플라스크에 1% 빙초산(v/v) 4 µL를 첨가한다(그림 1). 참고: 본 연구에서 유도제는 1% 빙초산을 용매로 사용하여 제조되었으므로, 대조군 단계로서 동일한 양의 용매만을 첨가하였다. 서로 다른 유도제의 준비 상태에 따라 대체 대조군을 고려할 수 있다. 1.5. 비유도 플라스크의 배양액 80 mL를 720 mL의 멸균 LB 배지에 넣고, 즉시 배양액 부피의 20%(160 mL)에 해당하는 중지 용액(얼음처럼 차가운 5% [v/v] 페놀, pH 4.3, 95% [v/v] 에탄올)을 첨가한 후, RNA 전사체를 안정화하기 위해 얼음 위에서 최소 30분에서 최대 2시간 동안 배양한다. 이것이 비유도 샘플이 된다. 1.6. 나머지 7개 250 mL 플라스크의 배양액(그림 1)을 적절한 유도제의 FMIC(최종 최소 억제 농도)로 유도(본 사례의 경우, 1% 빙초산 [w/v]로 제조된 25 mg·mL−1 norfloxacin을 최종 농도 1 µg·mL−1로 사용)하고, 잘 섞은 후 37 °C에서 180 rpm으로 1시간 동안 진탕 배양한다. 참고: 이 단계는 용원성 배양액을 더 조율된 상태의 용균성 복제로 강제 유도한다. 배양액 내 대부분의 세포가 감염성 파지 입자의 용균성 생성을 시작하게 된다. 1.7. 유도 플라스크의 배양액 80 mL를 720 mL의 멸균 LB 배지에 첨가하여 유도제를 효과적으로 희석함으로써 세포를 회복시킨다. 1.5단계에서 언급한 바와 같이 중지 용액을 첨가하여 0분부터 1시간까지 10분마다 각 플라스크에서 박테리아 세포를 수확한다. 참고: 중지 용액은 RNA를 최대 2시간까지 안정화한다. 그러나 샘플 안정성을 높이기 위해 이후의 모든 단계는 4 °C에서 수행한다. 1.8. RNA 분해를 방지하기 위해 처리 후 2시간을 초과하지 않도록 가능한 한 빨리 4 °C에서 10,000 x g로 15분간 원심분리하여 수확한다. 1.9. 상층액을 버리고, 각 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기기 전 조절 가능한 자동 피펫을 사용하여 잔류 액체 내의 박테리아 펠릿을 부드럽게 재현탁한다. 1.10. 마이크로 원심분리 튜브를 4 °C의 마이크로 원심분리기로 고속(13,000 x g)에서 1분간 원심분리하고 잔류 상층액을 버린다. 1.11. 밀봉된 각 마이크로 원심분리 튜브를 액체 질소에 담가 펠릿을 급속 냉동한다. 이는 RNA 추출을 위한 세포의 효율적인 용해를 돕는다. 1.12. 각 냉동 펠릿에 TRIzol(1 mL)을 첨가하고, 피펫팅을 통해 현탁액을 균질화한다(볼텍싱 금지). 모든 샘플의 RNA 추출을 수행할 때까지 −80 °C에 보관한다. 참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중단할 수 있다. 1.13. 세 번의 생물학적 반복 실험을 통해 1.1~1.12단계를 반복한다. Krishnamurthi, R., 외 등전사체 분석을 통한 온건성 박테리오파지가 라이소젠에 미치는 영향에 대한 이해. J. Vis. Exp. (2024)
이 영상은 박테리아 게놈에 통합된 프로파지의 용균성 복제 유도 방법과 전사체 분석을 위한 시간별 샘플링을 통한 유전자 발현 변화 포착 과정을 보여줍니다.
