형질전환된 포유류 세포로부터 아데노 부속 바이러스(Adeno-Associated Virus) 수확하기

초록

AAV(아데노 부속 바이러스) 수확 및 형질전환된 HEK293(인간 배아 신장 293) 세포의 화학적 용해 세포 배양 챔버를 세게 흔들어 세포를 떼어내고, 떨어진 세포로 인해 배지가 탁해 보일 때까지 수행한 후 500 mL 원심분리관 4개에 붓습니다. 4 °C에서 18,000 x g로 30분간 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 투명해진 상층액을 1 L 폴리에틸렌 테레프탈레이트 코폴리에스테르(PETG) 병에 붓습니다. 참고: 고속 원심분리기를 사용할 수 없는 경우, 12,000 x g에서 40분간 원심분리하십시오. 이 속도에서는 세포 펠릿이 단단하게 뭉치지 않아 상층액을 부을 때 함께 밀려 나갈 수 있습니다. 세포 펠릿을 50 mL의 용해 버퍼와 함께 500 mL 원심분리관에 재현탁하고 37 °C에서 60분간 배양합니다. 18,000 x g에서 30분간 원심분리한 후, 상층액을 동일한 1 L PETG 병으로 옮깁니다. 펠릿화된 세포 잔해는 폐기합니다. 참고: 투명해진 상층액은 즉시 정제하거나 최대 72시간 동안 4 °C에서 보관하십시오. 장기 보관 시에는 -80 °C에서 보관하십시오. -20 °C에서 보관하지 마십시오. Rghei, A. D., 등대동물 모델의 전임상 연구를 위한 셀 스택 내 아데노 부속 바이러스 벡터 생산. J. Vis. Exp. (2021)

본 영상에서는 화학적 용해와 원심분리를 이용하여 형질전환된 포유류 세포로부터 조 AAV(adeno-associated virus)를 회수하는 방법을 시연하며, 이를 통해 후속 정제 및 전임상 유전자 치료 응용을 위한 고수율 AAV 생산이 가능해집니다.

프로토콜

1. AAV (아데노 부속 바이러스) 수확 및 형질전환된 HEK293 (인간 배아 신장 293) 세포의 화학적 용해

1. 세포 배양 챔버를 강하게 흔들어 세포를 탈락시키고, 탈락된 세포로 인해 배지가 탁해 보일 때까지 흔든 후 500 mL 원심분리관 4개에 붓습니다.
2. 튜브를 4 °C에서 18,000 x g로 30분간 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 맑게 정제된 상층액을 1 L 폴리에틸렌 테레프탈레이트 코폴리에스터(PETG) 병에 붓습니다.참고: 고속 원심분리기를 사용할 수 없는 경우, 12,000 x g에서 40분간 원심분리하십시오. 이 속도에서는 세포 펠렛이 단단하게 형성되지 않아 상층액을 부어낼 때 함께 흘러나올 수 있습니다.
3. 500 mL 원심분리관에 담긴 세포 펠렛을 50 mL의 용해 완충액으로 재현탁하고 37 °C에서 60분간 배양합니다.
4. 튜브를 18,000 x g로 30분간 원심분리한 다음, 상층액을 동일한 1 L PETG 병으로 옮깁니다. 펠렛 형태로 남은 세포 잔해는 폐기합니다.참고: 정제된 상층액은 즉시 정제하고 4 °C에서 최대 72시간까지 보관하십시오. 장기 보관이 필요한 경우 -80 °C에 보관하십시오. -20 °C에 보관하지 마십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 chamber cellstack	Corning	3271
1L PETG 병	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
1000 mg/L D-glucose, L-glutamine 함유 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
소태아혈청 (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
HEK293 세포	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	세포 수령 즉시 해동하여 제조사의 프로토콜에 따라 배양하십시오. 세포를 최소한으로 계대 배양하여 잘 성장하면, 향후 사용을 위해 일부를 분주하여 냉동한 후 액체 질소에 보관하십시오. 항상 계대 번호 30회 미만의 세포를 사용하십시오. 배양된 세포의 계대 횟수가 30회를 초과하면, 보관된 분주액으로부터 배양을 다시 시작하는 것을 권장합니다.
대용량 원심분리 튜브 지지 쿠션	Corning	CLS431124	원심분리 로터에 적절한 V-bottom 쿠션이 없는 경우, 대용량 원심분리 튜브와 함께 지지 쿠션을 반드시 사용해야 합니다.
대용량 원심분리 튜브	Corning	CLS431123-6EA	500 mL 원심분리 튜브