1. 셀 스택 내 HEK293 세포의 이중 플라스미드 트랜스펙션
- 37 °C로 설정된 비드 배스(bead bath)에서 Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) 세포가 담긴 cryo-vial을 해동한다.
참고: 세포를 플레이팅할 때 콜드 쇼크(cold shock)를 방지하기 위해, 세포가 해동되는 동안 complete Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 37 °C로 미리 데워 둔다. 최적의 성장과 트랜스펙션 효율을 보장하기 위해 세포의 계대 수가 가급적 20회 미만인지 확인한다. 또한, 세포가 마이코플라스마 음성(mycoplasma-free) 인증을 받았는지 확인한다. - cryo-vial의 내용물을 37 °C로 데워진 complete DMEM 10 mL가 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브에 한 방울씩 옮기고, 세포를 500 × g에서 5분간 원심 분리한다.
- 배지를 흡입하여 제거한 후, HEK293 세포를 37 °C로 데워진 complete DMEM 20 mL에 재현탁한다. 세포를 15 cm 플레이트에 접종하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양한다.
- 하나의 15 cm 플레이트에 있는 세포를 나누어 세 개의 플레이트에 접종함으로써 세포 배양 챔버에 접종할 준비를 한다.
- 세포가 80% 정도 합쳐지면(confluent), 배지를 흡입하여 제거하고 3 mL의 인산완충식염수(PBS)로 플레이트를 부드럽게 세척하여 단층(monolayer)이 손상되지 않도록 한다. 그 다음, PBS를 흡입하여 제거하고 3 mL의 트립신(trypsin)을 첨가한다.
- 세포가 플레이트에서 떨어질 때까지 37 °C에서 2분간 배양한 후, 플레이트에 7 mL의 complete DMEM을 첨가하여 트립신을 중화시킨다.
- 모든 배지와 세포를 15 mL 튜브에 수집하고, 500 × g에서 5분간 원심 분리하여 세포 펠릿을 형성한다.
- 15 mL 튜브에서 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠릿을 3 mL의 complete DMEM에 재현탁한다. complete DMEM 20 mL가 들어 있는 각 15 cm 플레이트에 1 mL씩 첨가하고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 균일하게 분산시킨 뒤 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양한다.
- 세포가 80% 정도 합쳐지면, 단계 1.4.1과 1.4.2를 반복한다. 상층액을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하고, 튜브를 부드럽게 뒤집어 세포가 균질하게 섞이도록 한다.
- 세포 샘플 10 µL와 트립판 블루(trypan blue) 10 µL를 혼합하여 세포 계수 슬라이드에 넣고, 세포 계수기로 분석하여 세포 밀도를 결정한다.
- 37 °C로 데워진 complete DMEM 1 L에 필요한 양의 세포 현탁액을 혼합하여, 세포 배양 챔버(표면적 6360 cm2)에 1 × 104 cells/cm2 밀도로 접종한다. 세포 혼합액을 세포 배양 챔버에 붓고 부드럽게 회전시켜 각 단층에 세포가 균일하게 분산되도록 한 후(그림 1), 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양한다.
- 세포 배양 챔버와 더불어, 합쳐짐(confluency) 정도를 확인하기 위한 대조군으로 15 cm 플레이트에도 1 × 104 cells/cm2 밀도로 접종한다.
- 약 65시간의 배양 후, 대조군 플레이트의 합쳐짐 정도가 가급적 80%-90%인지 확인한다.
참고: 세포 배양 챔버에 첨가할 complete DMEM은 37 °C로 미리 데워 둔다. - polyethyleneimine (PEI)/DNA 혼합물을 3:1 (w/w) 농도 비율로 준비한다.
- 50 mL 원뿔형 튜브에 40 mL의 저혈청 배지(reduced-serum medium)를 넣고 pTrangene 475 µg과 pHelper 1425 µg을 첨가하여, pHelper:pTrangene 비율이 3:1이 되도록 DNA 혼합물을 준비한다.
참고: PEI/DNA 혼합물 계산기는 표 1을 통해 확인할 수 있다.
| 세포 배양 챔버의 형질전환 | | | |
| 프로토콜 | | | | | |
| 1. 형질전환 전 DNA, OptiMEM 및 PEI를 실온으로 가온한다 |
| 2. 형질전환할 세포 스택의 수를 입력한다 (추가량 필요 없음) | |
| 3. DNA 농도에 따라 필요한 부피가 달라지므로 농도가 정확한지 확인한다 |
| 세포 배양 챔버 수 | 1 | | | |
| 트랜스진 플라스미드 농도 | 1 | mg/mL | | |
| pDGM6.2FF 플라스미드 농도 | 1 | mg/mL | | |
| | | 세포 배양 챔버당 양 | 형질전환 마스터믹스 |
| | OptiMEM | 48.1 | mL | 48.1 | mL |
| pTransgene:pHelper 비율 1:3 | pTransgene | 475 | µg | 475 | µL |
| | pHelper | 1425 | µg | 1425 | µL |
| 4. 필요한 부피의 OptiMEM과 플라스미드 DNA를 50 mL 원추형 튜브에 넣는다 | |
| 5. 10회 반전 혼합한다 | | | | | |
| PEI:DNA 비율 3:1 | PEI Max | 5.7 | mL | 5.7 | mL |
| 6. OptiMEM과 플라스미드 DNA가 들어 있는 50 mL 튜브에 필요한 양의 PEI를 추가한다 |
| 7. 즉시 50 mL 튜브를 닫고, 볼텍싱 후 3~5회 반전하여 혼합한다. | |
| 8. PEI 복합체 인큐베이션을 위해 10분간 타이머를 설정한다 | | | |
| 9. 형질전환할 세포 스택을 생물안전작업대(BSC)로 옮긴다 | | | |
| 10. 10분 후, 형질전환 믹스를 오렌지색 포트 하나에 붓는다. | | |
| 11. 세포 스택 전체에 액체가 섞이도록 부드럽게 혼합한다 | | | |
| 12. 각 층에 동일한 부피가 들어가도록 확인하며 형질전환된 세포 스택을 인큐베이터로 되돌린다 |
| 13. 72시간 후 세포 배양 챔버를 회수한다 | | | | |
표 1: 세포 배양 챔버용 형질전환 계산기. 세포 배양 챔버의 형질전환을 위해 pTransgene, pHelper 및 PEI의 정확한 농도를 결정하는 대화형 워크시트.
2. 저혈청 배지와 DNA 혼합물에 PEI (1 g/L) 5.7 mL를 한 방울씩 첨가합니다. 그런 다음, 짧게 볼텍싱하고 상온에서 10분 동안 배양합니다.
참고: PEI/DNA를 상온에서 배양하면 용액이 약간 탁해집니다.
- PEI/DNA를 8분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 챔버에서 배지를 제거합니다.
참고: 세포가 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해 두 개의 주황색 캡을 모두 느슨하게 풀어 배지가 원활하게 흐르도록 하십시오. - PEI/DNA를 미리 데워둔 1 L의 완전 DMEM에 넣고, 혼합물을 세포 배양 챔버 포트에 천천히 붓습니다. 액체를 모든 행에 고르게 분배하고(그림 1), 37 °C, 5% CO2 조건에서 72시간 동안 인큐베이션합니다.
2 아데노 부속 바이러스(AAV) 수확 및 형질전환된 HEK293 세포의 화학적 용해
- 배양액이 떨어져 나온 세포들로 인해 탁해 보일 때까지 세포 배양 챔버를 세게 흔들어 세포를 분리한 후, 500 mL 원심분리 튜브 4개에 붓습니다.
- 튜브를 4 °C에서 18,000 × g로 30분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 맑게 된 상층액을 1 L 폴리에틸렌 테레프탈레이트 코폴리에스터(PETG) 병에 붓습니다.
참고: 고속 원심분리기를 사용할 수 없는 경우, 12,000 × g로 40분 동안 원심분리하십시오. 이 속도에서는 펠렛화된 세포가 단단하지 않을 수 있으며 상층액을 부을 때 함께 밀려 나올 수 있습니다. - 세포 펠렛을 50 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)와 함께 500 mL 원심분리 튜브에 재현탁하고 37 °C에서 60분 동안 배양합니다.
- 튜브를 18,000 × g로 30분 동안 원심분리한 후, 상층액을 동일한 1 L PETG 병으로 옮깁니다. 펠렛화된 세포 파편은 폐기합니다.
참고: 맑게 된 상층액은 즉시 정제하거나 4 °C에서 최대 72시간 동안 보관하십시오. 장기 보관이 필요한 경우 -80 °C에 보관하십시오. -20 °C에는 보관하지 마십시오.
3 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용한 AAV 벡터 정제
- 조제된 용해물을 -에서 제거하십시오.80 °C 및 ~에 그대로 둡니다. 4 °C 밤새 해동한다. 해동이 완료되면, 다음을 사용한다. 0.22 µM 조조성 용해물을 여과하기 위한 필터.
- 원심분리 농축기를 패시베이션(passivation)하려면, 사용하는 각 헤파린 세파로스(heparin sepharose) 컬럼당 4 mL의 필터 전처리 완충액을 원심분리 농축기에 첨가하십시오. 실온에서 2~8시간 동안 원심분리 농축기를 패시베이션합니다. 정제 단계 직전에 패시베이션을 준비하십시오.
- 튜브와 펌프를 설치합니다 (그림 2).
- 튜빙을 연동 펌프에 장착하고 1 M NaOH 20 mL를 흘려줍니다. 그다음 분자 생물학 등급의 증류수(molecular grade water) 50 mL를 흘려준 후, 기초 DMEM 50 mL를 흘려줍니다.
- 5 mL heparin sepharose 컬럼을 튜빙에 연결하고, 보존제를 제거하기 위해 basal DMEM 25 mL를 흘려줍니다.
- 실행 0.2 µM 여과된 조추출액을 1-2방울/초의 유속으로 컬럼에 통과시킵니다.
주의 사항: 기포가 유입되거나 컬럼이 마르지 않도록 주의하십시오. 이는 컬럼의 성능을 저하시켜 AAV의 용출을 방해할 수 있습니다. 만약 컬럼이 말랐다면 해당 컬럼은 폐기하고, 남은 조추출물(crude lysate)에는 새 컬럼을 사용하십시오.
- 모든 조추출물을 헤파린 컬럼에 로딩하고, 다음 용액들을 사용하여 컬럼을 세척하십시오.
- 1의 50 mL를 사용하여 세척하십시오.× Mg 미포함 Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS)2+ 및 Ca2+.
- Mg가 포함되지 않은 HBSS 내의 0.5% N-Lauroylsarcosine 15 mL를 사용하여 세척한다.2+ 및 Ca2+.
- Mg가 포함되지 않은 HBSS 50 mL를 사용하여 세척하십시오.2+ 및 Ca2+.
- Mg가 포함된 HBSS 50 mL를 사용하여 세척하십시오.2+ 및 Ca2+
- 200 mM NaCl/Mg 포함 HBSS 50 mL를 사용하여 세척하십시오.2+ 및 Ca2+.
- 용출액 5 × 5 mL (총 25 mL), Mg가 포함된 300 mM NaCl/HBSS 포함2+ 및 Ca2+ 용출액을 E1-E5로 표시하십시오 (각 용출액은 5 mL입니다).
- 원심 분리 농축기를 이용한 바이러스 농축
- 전처리 완충액이 담긴 원심분리 농축기를 900에서 회전시킵니다. × 2분 동안 원심분리합니다. 통과액은 폐기합니다.
- 원심분리 농축기 필터를 Mg가 포함된 HBSS 4mL로 세척하십시오.2+ 및 Ca2+ 및 1000에서 원심분리하고 × 2분 동안 원심분리하고, 통과액은 버립니다.
- 용출액 E2를 원심분리 농축기에 넣습니다. 1000에서 원심분리하십시오. × 5분 동안 원심분리하고 통과액은 버린다.
- E2의 첨가를 마치고 E3를 원심분리 농축기에 넣은 후 1000에서 원심분리하십시오. × 농축된 바이러스의 부피가 약 1 mL가 될 때까지 5분 동안 원심분리합니다.
참고: 벡터를 원심분리할 때 부피가 필터 높이보다 낮아지지 않도록 주의하십시오. E1, E4 또는 E5 분획은 벡터가 거의 없거나 전혀 포함되어 있지 않으며 오염 물질이 포함되어 있으므로, 원심분리 농축기로 농축하지 마십시오. - p200 필터 팁을 사용하여 원심분리 농축기에서 농축된 바이러스를 제거한 후, 이를 멸균된 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮기십시오.
- 원심분리 농축기를 다음으로 헹굽니다. 200 µL Mg가 포함된 HBSS의2+ 및 Ca2+ 필터에 남아 있는 모든 AAV를 제거합니다. 멤브레인에 부착된 바이러스를 제거하기 위해 여러 번 격렬하게 피펫팅(약 30초 동안)한 후, 나머지 바이러스가 들어 있는 1.5 mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 튜브를 잘 섞어줍니다.
- 분주물 5 µL DNA 추출을 위해 정제된 벡터를 -에서 보관하십시오.80 °C.
- 2 M NaCl 25 mL를 사용하여 컬럼을 세척하십시오. 이어서, 다음 온도로 미리 가열한 0.1% Triton X-100 25 mL를 사용하십시오. 37 °C 컬럼을 세척합니다. 다음으로, 50 mL의 멸균 dH2O를 사용하여 컬럼을 세척합니다.2그다음 20% 에탄올 25 mL를 사용하여 세척하십시오.
- 컬럼 막이 보관 용액인 20% 에탄올에 완전히 포화되었는지 확인하십시오. 제공된 플러그로 컬럼을 밀봉하여 다음 온도에서 보관하십시오. 4 °C.
- 튜브를 1 M NaOH에 보관하십시오.
참고: 적절하게 세척할 경우, heparin sepharose 컬럼은 최대 5회까지 재사용할 수 있습니다.
