동물 샘플을 이용한 모든 절차는 관련 동물 윤리 심의 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다. 투명대 하단 1세포기 배아로의 렌티바이러스 벡터 미세주입 참고: 미세주입에는 두 개의 전핵이 관찰되는 1세포기 배아를 사용하십시오(그림 1). 렌티바이러스(LV) 분주액을 상온에서 해동하고, 10,0 x g, 상온(RT)에서 2분간 원심분리하여 남아 있는 세포 잔해를 침전시킵니다. 미세주입 설정 마이크로포지를 사용하여 유리 홀딩 피펫(붕규산 유리 모세관)을 준비합니다. 유리 모세관을 불꽃 위에서 당겨 5~10cm 길이의 팁을 만듭니다. 피펫을 부러뜨려 약 4cm의 팁만 남깁니다. 외경은 약 80~120µm여야 합니다. 참고: 피펫 팁이 완전히 곧고 매끄러운지 확인하십시오. 당겨진 피펫을 마이크로포지에 조립하고 팁을 가열 필라멘트 앞에 둡니다. 필라멘트를 피펫 팁에 매우 가깝게 가열하여 직경이 약 15µm(배아 크기의 약 20%)가 될 때까지 수축시킵니다. 피펫을 가열 필라멘트와 수직이 되도록 팁에서 2~3mm 떨어진 곳에 배치하고 가열을 시작합니다. 유리가 부드러워지면 15° 각도가 될 때까지 가열합니다. 피펫 풀러와 필라멘트를 사용하여 미세주입용 붕규산 유리 모세관을 준비합니다. 모세관을 풀링 챔버에 삽입합니다. 램프 테스트를 실행합니다(새 유리를 사용할 때 처음 한 번, 그리고 필라멘트를 교체할 때마다 실행). 가열(Heat)은 램프 값에서 -10, 당기(Pull)는 10, 속도(Velocity)는 150, 시간(Time)은 10으로 설정합니다. 참고: 최적의 주입용 모세관을 얻기 위해 파라미터를 수정하십시오. 생물안전 라미나 플로우 후드 아래에서 마이크로더 팁을 사용하여 미세주입 피펫에 약 2µL의 바이러스 용액을 채웁니다. 60mm 페트리 접시 뚜껑으로 미세주입 접시를 준비하고, 중앙에 10µL의 M2 배지 방울을 떨어뜨린 후 액체 파라핀 또는 미네랄 오일로 덮습니다. 바이러스 용액이 채워진 홀딩 피펫과 미세주입 모세관을 도립 현미경 아래의 마이크로매니퓰레이터와 미세주입 접시에 장착합니다. 미세주입 수행 15~20개의 1세포기 배아를 미세주입 접시의 M2 방울로 옮깁니다. 홀딩 피펫을 사용하여 배아를 고정합니다. 40배율에서 자동 주입기가 연결된 유리 모세관을 사용하여 투명대 하단의 난주위강으로 LV 용액을 주입합니다. 모세관을 투명대 하단에 잠시 유지합니다. 참고: 부드러운 양압을 사용하면 바이러스 용액이 주입 모세관 밖으로 지속적으로 흐르지만, 전달되는 현탁액의 부피는 조절할 수 없습니다. 미세 피펫을 사용하여 배아를 37°C, 5% CO2 환경의 인큐베이터 내 배양 접시로 되돌립니다. 하나의 접합자에 대한 주입 횟수는 다를 수 있으며, 바이러스 벡터 농도에 따라 조정할 수 있습니다. 참고: 주입된 배아는 1세포기 단계에서 대리모에게 이식하거나, M16 배지에서 하룻밤(O/N) 배양한 후 2세포기 단계에서 이식할 수 있습니다. 랫드 배아의 장기간 체외 배양은 피해야 합니다. Koza, P., 외 외. 렌티바이러스 벡터 접근법을 이용한 형질전환 쥐 제작 J. Vis. Exp. (2020)
이 영상은 형질전환 쥐 제작을 위해 안정적인 트랜스진 통합을 달성하고자 수정된 쥐 배아에 렌티바이러스 벡터를 미세주입하여 전달하는 방법을 보여줍니다.
