코로나바이러스 스파이크 단백질 및 강화 녹색 형광 단백질(VSV-S-eGFP)을 발현하는 수포성 구내염 바이러스 가성바이러스 역가 측정 1. 바이러스 역가 결정을 위한 계열 희석 1. Vero E6 세포를 웰당 6 × 10⁵ cells의 파종 밀도로 10% FBS(소태아혈청)가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium 또는 DMEM을 사용하여 6-웰 플레이트에 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양한다. 참고: TMPRSS2와 hACE2를 과발현하는 Vero 세포를 사용할 수도 있다. 2. 7개의 마이크로원심분리관에 배지 900 μL씩을 넣어 차가운 무혈청 DMEM으로 VSV-SeGFP 바이러스의 10배 계열 희석 시리즈를 준비한다. 튜브에 1번부터 7번까지 번호를 매긴다. 첫 번째 튜브에 바이러스 스톡 100 μL를 넣고 짧게 볼텍싱한다. 1번 튜브에서 희석된 바이러스 100 μL를 2번 튜브로 옮기고 짧게 볼텍싱하며, 이 과정을 7번 튜브까지 반복한다. 3. Vero E6 세포가 들어 있는 6-웰 플레이트의 모든 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 10⁻⁵에서 10⁻⁷ 희석액 500 μL로 교체한다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 45분 동안 배양하며, 15분마다 부드럽게 흔들어준다. 4. 접종액을 흡입하여 제거하고, 2x DMEM과 6% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 1:1로 혼합하여 최종 농도가 3% CMC가 되도록 하고 10% FBS를 보충한 오버레이 용액으로 교체한다. 그 후 34 °C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양한다. 참고: 감염 단계 동안 오버레이 혼합물을 37 °C 항온수조에서 15분 동안 예열한다. CMC 대신 10% FBS를 보충한 2x DMEM과 1% 아가로스의 1:1 혼합물을 사용할 수 있다. 아가로스로 오버레이하려면 1% 아가로스(dH₂O 내)를 끓인 후 차가운 2x DMEM과 혼합한다. 세포 단층에 추가하기 전 혼합물이 적절한 온도(약 37-40 °C)인지 확인한다. 오버레이에 아가로스를 사용한 경우, 염색 전 최소 1시간 동안 3:1 메탄올:아세트산 2 mL에서 배양하여 세포를 고정해야 한다. 2. 염색 및 바이러스 역가 계산 1. 크리스탈 바이올렛으로 염색하거나 형광 현미경으로 eGFP를 직접 관찰하여 플라크를 시각화한다. 2. 플레이트를 염색하려면 오버레이를 흡입하여 제거하고 PBS로 한 번 세척한 다음, 각 웰에 0.1% 크리스탈 바이올렛(80% 메탄올 및 dH₂O 내) 2 mL를 넣는다. 탈색 전 실온의 플레이트 로커에서 약 20분 동안 둔다. 크리스탈 바이올렛을 제거하고 dH₂O 또는 PBS를 사용하여 각 웰을 부드럽게 두 번 세척한다. 참고: 세척 및 염색 단계는 절차 전반에 걸쳐 세포 단층이 유지되도록 각 웰의 측면을 향해 천천히 피펫팅하여 부드럽게 수행해야 한다. 3. 플라크 수를 세기 전 플레이트를 최소 1시간 동안 건조시킨다. 플라크 수가 20개에서 200개 사이인 웰에서 플라크 수를 측정한다. mL당 플라크 형성 단위(PFU)로 바이러스 역가를 계산하려면, 해당 웰의 플라크 수를 측정된 웰의 희석 배수와 감염 부피의 곱으로 나눈다. Jamieson, T. R., 등, 가성바이러스 감염의 고처리량 형광 이미징을 이용한 SARS-CoV-2 중화항체 검출 J. Vis. Exp. (2021)
본 영상에서는 코로나바이러스 유사바이러스 입자를 이용한 바이러스 플라크 분석법을 설명합니다. 희석된 유사바이러스를 포유류 세포 단층에 첨가한 후, 메틸셀룰로오스 오버레이와 함께 배양합니다. 감염된 세포에 의해 형성된 플라크를 육안으로 계수하여 감염성 바이러스 역가를 결정합니다.
