환자 혈청을 이용한 코로나바이러스 스파이크 단백질 발현 슈도바이러스의 항체 매개 중화 반응

초록

샘플 수집과 관련된 모든 절차는 기관의 IRB 가이드라인에 따라 수행되었습니다. 항체 또는 혈청 희석 및 감염 참고: 이 프로토콜은 상용 항체와 환자 혈청뿐만 아니라 전임상 백신 개발 연구를 위해 동물에서 수집한 혈청을 사용하여 코로나바이러스 스파이크 단백질 및 강화 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 수포성 구내염 바이러스(VSV-S-eGFP) 유사바이러스의 중화 능력을 측정하는 데 적용할 수 있습니다. 단계별 희석 시리즈 혈청 샘플을 희석하기 전, 보체를 비활성화하기 위해 각 샘플을 56 °C 항온수조에서 30분 동안 가열 비활성화합니다. 환자 샘플을 취급할 때 필요한 안전 예방 조치를 취하십시오. 샘플 용기는 조직 배양 후드 내에서만 열어야 하며, 적절한 생물안전 2등급(containment level 2) 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 빈 96-웰 플레이트(Plate 1)에 희석 시리즈를 설정합니다. 96-웰 플레이트의 A행의 모든 희석은 80 µL로 시작합니다. *환자 샘플의 경우, 72 µL의 무혈청 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) (1% penicillin/streptomycin 포함)에 8 µL의 혈청을 넣어 1:10 희석부터 시작합니다. 참고: 사용하는 중화 항체의 농도는 제조사에서 예측한 활성에 따라 달라집니다. 본 실험에 사용된 SARS-CoV-2 Spike 중화 항체(재료 표 참조)의 경우, 최소 50%의 중화를 관찰하기 위해 5 µg/mL부터 시작하십시오. B행부터 G행까지는 40 µL의 무혈청 DMEM (1% penicillin/streptomycin 포함)을 추가하고, H행에는 80 µL를 추가합니다. H행은 세포 단독 대조군으로 사용되므로 바이러스를 추가하지 마십시오. 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여 A행의 희석된 혈청 또는 항체 40 µL를 혼합하여 B행으로 옮깁니다. F행까지 이 과정을 반복하여 혼합하고, F행에서 40 µL를 제거합니다. G행은 바이러스 단독 대조군 행이므로 혈청을 추가하지 마십시오. 감염 및 오버레이 각 웰을 감염 다중도(MOI) 0.05(또는 2000 plaque-forming units (pfu))로 처리할 수 있도록 적절한 부피의 희석된 VSV-S-eGFP를 준비합니다. (이 계산을 수행할 때, 총 80 µL 부피 중 60 µL만 세포로 옮겨진다는 점을 염두에 두십시오. 따라서 2000 pfu를 유지하려면 바이러스 부피에 1.33을 곱해야 합니다). 참고: VSV-S-eGFP는 온도에 민감하므로, 사용하지 않을 때는 항상 바이러스 스톡을 얼음 위에 보관하고, 반복적인 냉동-해동 주기를 피하십시오. 반복 냉동 시 역가가 달라질 수 있습니다. Plate 1의 A행부터 G행의 각 웰에 희석된 바이러스 40 µL를 추가하고 피펫팅으로 4-5회 섞어줍니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 세포가 들어 있는 플레이트(Plate 2)를 배양기에서 꺼내고 모든 웰의 배지를 조심스럽게 흡입 제거합니다. Plate 1의 항체/바이러스 혼합액 60 µL를 Plate 2로 옮기고, 20분마다 플레이트를 흔들어주며 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 최종 농도가 3% CMC(10% FBS(소태아혈청) 및 1% penicillin/streptomycin 포함)가 되도록 DMEM 내에 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)가 포함된 오버레이 액 140 µL를 각 웰에 채웁니다. Plate 2를 34 °C, 5% CO2로 설정된 배양기에 넣고 이미징 전까지 약 24시간 동안 배양합니다. 참고: 감염 단계 동안 오버레이 혼합액을 37 °C 항온수조에서 15분 동안 예열하십시오. 2. 이미징 및 정량화 (3일차) 자동 형광 이미저(fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터 또는 여기 파장이 488 nm인 대체 필터 사용)를 사용하여 플레이트를 이미징합니다. 개별 eGFP (강화 녹색 형광 단백질) 포커스를 자동으로 식별하고 계산하는 프로토콜을 만들어 바이러스 감염을 정량화합니다. 자동 계산 기능을 사용할 수 없는 경우, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 eGFP 포커스 수를 정량화하십시오. Jamieson, T. R., 등. 가상 바이러스 감염의 고처리량 형광 이미징을 이용한 SARS-CoV-2 중화항체 검출 J. Vis. Exp. (2021)

이 영상은 감염된 상피세포 단층의 고처리량 형광 이미징을 통해, 환자 혈청을 사용하여 코로나바이러스 스파이크 단백질을 탑재한 슈도바이러스의 항체 매개 중화 반응을 연구하는 과정을 보여줍니다.

프로토콜

시료 수집과 관련된 모든 절차는 기관의 IRB 가이드라인에 따라 수행되었습니다.

1. 항체 또는 혈청 희석 및 감염

참고: 이 프로토콜은 상용 항체와 환자 혈청뿐만 아니라 전임상 백신 개발 연구를 위해 동물에서 수집한 혈청을 사용하여, 코로나바이러스 스파이크 단백질 및 강화 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein)을 발현하는 수포성 구내염 바이러스(VSV-S-eGFP) 가성 바이러스의 중화 능력을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.

1. 단계별 희석 시리즈
   1. 혈청 샘플을 희석하기 전, 보체(complement)를 불활성화시키기 위해 각 샘플을 56 °C 항온수조에서 30분 동안 열처리하여 불활성화시킨다. 환자 샘플을 취급할 때는 필요한 안전 예방 조치를 반드시 준수해야 한다. 샘플 용기는 조직 배양 후드 내에서만 열어야 하며, 적절한 생물안전 2등급(containment level 2) 개인 보호 장비를 착용해야 한다.
   2. 빈 96-well 플레이트(Plate 1)에 희석 시리즈를 설정한다.
   3. 96-well 플레이트의 Row A에서 모든 희석을 80 µL로 시작한다. *환자 샘플의 경우, 72 µL의 무혈청 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) (1% penicillin/streptomycin 포함)에 8 µL의 혈청을 넣어 10배 희석으로 시작한다.
      참고: 사용하는 중화 항체의 농도는 제조사에서 예측한 활성에 따라 달라진다. 본 실험에서 사용된 SARS-CoV-2 Spike 중화 항체(재료 표 참조)의 경우, 최소 50%의 중화를 관찰하기 위해 5 µg/mL부터 시작한다.
   4. Row B부터 G까지는 무혈청 DMEM (1% penicillin/streptomycin 포함) 40 µL를 추가하고, Row H에는 80 µL를 추가한다. Row H는 세포 단독 대조군으로 사용되므로 바이러스를 추가하지 않는다.
   5. 12-well 멀티채널 피펫을 사용하여 Row A의 희석된 혈청 또는 항체 40 µL를 혼합하여 Row B로 옮긴다. Row F까지 혼합 및 이동을 반복한 후, Row F에서 40 µL를 버린다. Row G는 바이러스 단독 대조군 행이므로 혈청을 추가하지 않는다.
2. 감염 및 오버레이
   1. 각 well을 감염 다중도(MOI) 0.05(또는 2000 plaque-forming units (pfu))로 처리할 수 있도록 적절한 부피의 희석된 VSV-S-eGFP를 준비한다. (이 계산을 수행할 때, 총 80 µL 부피 중 60 µL만 세포로 옮겨진다는 점을 유의해야 한다. 따라서 2000 pfu를 유지하려면 바이러스 부피에 1.33을 곱해야 한다).
      참고: VSV-S-eGFP는 온도에 민감하므로 사용하지 않을 때는 항상 바이러스 스톡을 얼음 위에 보관하고, 반복적인 동결 및 해동은 역가(titer)를 변화시키므로 여러 번의 동결-해동 사이클을 피해야 한다.
   2. Plate 1의 Row A부터 G까지 각 well에 희석된 바이러스 40 µL를 추가하고 피펫팅을 4-5회 반복하여 혼합한다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양한다.
   3. 배양기에서 세포가 들어 있는 플레이트(Plate 2)를 꺼내고, 모든 well의 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한다. Plate 1의 항체/바이러스 혼합액 60 µL를 Plate 2로 옮기고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양하며 20분마다 플레이트를 흔들어준다.
   4. 최종 농도가 3% CMC (10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% penicillin/streptomycin 포함)가 되도록 DMEM 내에 carboxymethyl cellulose (CMC)가 포함된 오버레이 용액 140 µL를 각 well에 채운다. 이미징 전까지 Plate 2를 34 °C, 5% CO₂ 로 설정된 배양기에서 약 24시간 동안 보관한다.
      참고: 감염 단계 동안 오버레이 혼합액을 37 °C 항온수조에서 15분 동안 예열한다.

2. 이미징 및 정량화 (3일 차)

1. 자동 형광 이미저(fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터 또는 여기 파장이 488 nm인 대체 필터 사용)를 사용하여 플레이트를 촬영합니다. 개별 eGFP (enhanced green fluorescent protein) 포커스를 자동으로 식별하고 계산하는 프로토콜을 생성하여 바이러스 감염을 정량화합니다. 자동 계산 기능이 없는 경우, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 eGFP 포커스 수를 정량화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Carboxymethyl cellulose	Sigma	C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Vero E6 cells	ATCC	CRL-1586
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV