1. 세포 플레이팅 플레이트에서 HeLa 세포를 분리하고 성장 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% 소태아혈청 [FBS])로 희석하여 약 2.0 x 10⁵ cells/ml 농도로 맞춘다. 검은색 벽면과 투명한 평평한 바닥을 가진 96-well 플레이트에 웰당 100 μl(20,000 cells/well)씩 분주한다. 37 °C 인큐베이터(+ 5% CO₂)에서 세포가 합쳐질(confluent) 때까지 24시간 동안 배양한다. 2. 세포 감염 바이러스를 희석하여 세포를 감염시킨다. TrpV(Triple virus; Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) 및 PLV(Promoter-less Venus) 형광 바이러스를 해동하고 5분 동안 초음파 처리하여 응집물을 제거한다. 또는, 조제 바이러스 스톡을 감염 배지 내의 0.25 mg/ml 트립신과 1:1로 혼합하여 37 °C에서 30분 동안 배양할 수 있다. 조제 바이러스 스톡을 37 °C 감염 배지(DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS)로 희석한다. 높은 MOI 감염(10 PFU/cell)의 경우, 웰당 5 x 10⁴ cells와 접종 부피 50 μl를 가정하여 바이러스 스톡을 1.0 x 10⁷ PFU/ml로 희석한다. 각 처리군당 TrpV로 감염시킨 3개의 반복 웰과, 각 처리의 배경 형광을 고려하기 위해 동일한 처리를 거친 PLV 감염 3개의 반복 웰을 준비한다. 감염 배지로 희석한 바이러스를 웰당 50 μl씩 첨가하여 감염시킨다. 이 시점을 감염 후 0시간(0 hpi)으로 정의한다. 37 °C 인큐베이터(+ 5% CO₂)에서 6-24시간 동안 배양한다. 3. 세포 고정 각 웰의 감염 배지에 8% 파라포름알데히드 100 μl를 첨가하여 세포를 고정한다. 빛을 차단한 상태에서 실온의 15분 동안 배양한다. 참고: 고정 전 고역가 배지를 폐기 용기에 직접 들이부을 때 발생할 수 있는 전염성 백시니아 바이러스의 에어로졸화를 방지하기 위해, 2x 파라포름알데히드(8%)를 감염 배지에 직접 첨가하는 것이 권장된다. 플레이트를 폐기 용기에 뒤집어 고정액을 제거한다. 실온의 인산염 완충 식염수(PBS) 100 μl를 첨가한다. 광학적으로 투명한 접착 필름으로 플레이트를 밀봉한다. 참고: 즉시 측정하지 않을 경우 플레이트를 4 °C에 보관할 수 있다. 단, 결로로 인해 분광광도계 측정값이 왜곡되는 것을 방지하기 위해 측정 전 밀봉된 플레이트를 반드시 실온으로 되돌려 놓아야 한다. Rozelle, D. K., 외. 유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 기능을 정량화하기 위한 백시니아 리포터 바이러스. J. Vis. Exp. (2014)
이 영상에서는 단계 특이적 프로모터에 의해 조절되는 형광 리포터를 사용하여 백시니아 바이러스의 복제를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 녹색, 적색, 청색 형광 단백질의 순차적 발현은 감염의 초기, 중간 및 후기 단계를 표시하며, 이를 통해 단계 특이적 바이러스 유전자 발현의 고속 대량 분석이 가능해집니다.
