감염된 곤충 체내 바이러스의 분리 및 정제

초록

전체 바이러스 추출 바이러스 양성 H. vitripennis의 전체 몸체를 0.02% sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DETCA)가 포함된 pH ~7.2 인산염 완충액에 넣고, 큰 조직 덩어리가 더 이상 남아 있지 않을 때까지 약 10초 간격으로 볼텍싱하여 균질화한다. 4 °C에서 124,500 x g로 4시간 또는 22,000 x g로 16시간 동안 초고속 원심분리를 하여 바이러스를 추출한다. 상단에 침전물이 형성되면 멸균 면봉으로 제거한다. 상층액은 폐기한다. 펠릿을 수집하고 0.4% Na-deoxycholic acid와 4% polyethylene glycol hexadecyl ether (Brij 52)가 포함된 10 mM 인산염 완충액(DETCA 미포함), pH ~7.2 5 ml로 용해시킨다. 펠릿을 잘 섞기 위해, 필요한 경우 튜브 벽면에서 펠릿을 떼어내어 용액 상태가 될 때까지 으깬다. 펠릿의 용해를 돕기 위해 필요한 경우 10 mM 인산염 완충액을 약 5 ml씩 추가로 첨가하고, 이를 2개의 튜브에 나누어 담는다. 용액을 300 x g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 제거하고 용액을 0.45 μm 필터에 통과시킨 후, 여과액을 큰 수집 튜브에 수집한다. 필요한 경우 DETCA가 포함되지 않은 10 mM 인산염 완충액(pH 7)을 소량 사용하여 여과액을 분자량 컷오프(MWCO) 3.5 kD의 투석막으로 옮긴다. 투석막을 ddH2O가 채워진 4 °C의 큰 비커에 넣는다. 막 내부에 흰색 침전물이 형성될 때까지 5~6시간 동안 매 시간 ddH2O를 교체한다. 막 내부에서 정제된 바이러스를 수집하고, 100% 바이러스 용액 10 μl를 90 μl의 ddH2O에 첨가하여 10배 희석 계열을 만든다. 이후 희석 배수가 1:100,000에 도달할 때까지 희석액 10 μl를 또 다른 90 μl의 ddH2O에 첨가한다. 바이러스 용액은 -80 °C에서 보관한다. Biesbrock, A. M. 등. 의 증식 Homalodisca coagulata virus-01 ~를 통해 Homalodisca vitripennis 세포 배양 J. Vis. Exp. (2014)

본 영상에서는 곤충 유래 숙주 세포를 이용한 Homalodisca coagulata Virus-01의 인비트로(in vitro) 증식 방법을 시연합니다. 바이러스 정제, 접종 및 배양된 곤충 세포 내에서의 복제 단계에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. Whole Virus Extraction

1. Homogenize whole bodies of virus-positive H. vitripennis in phosphate buffer, pH ~7.2, with 0.02% sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DETCA) by vortexing for ~10 sec intervals until there are no more large clumps of tissue present. Extract virus via superspeed centrifugation at 124,500 x g for 4 hr at 4 °C or 22,000 x g for 16 hr at 4 °C. If a precipitate forms at the top, remove it with a sterile cotton swab.
2. Discard the supernatant.
3. Collect the pellet and dissolve with 5 ml of 10 mM phosphate buffer (no DETCA), pH ~7.2, containing 0.4% Na-deoxycholic acid and 4% polyethylene glycol hexadecyl ether (Brij 52).
   1. To mix the pellet well, remove the pellet from the side of the tube and crush it up until it is in solution, if necessary.
   2. Add an additional 10 mM phosphate buffer in ~5 ml increments to help the pellet go into solution if needed, and combine into 2 tubes.
4. Centrifuge the solution at 300 x g for 15 min.
5. Remove the supernatant and pass the solution through a 0.45 μm filter, and collect the filtrate in a large collection tube.
6. Transfer filtrate to a dialysis membrane with a molecular weight cut off (MWCO) of 3.5 kD, using small amounts of 10 mM phosphate buffer (pH 7) containing no DETCA if needed.
7. Place the dialysis membrane in a large beaker filled with ddH₂O at 4 °C. Change the ddH₂O every hour for 5 - 6 hr, until a white precipitate forms in the membrane.
8. Collect the purified virus from within the membrane and subject the 100% virus solution to a 10-fold dilution series by adding 10 μl of solution to 90 μl of ddH₂O. Subsequently, add 10 μl of the dilution to another 90 μl of ddH₂O until reaching a dilution of 1:100,000.
9. Store virus solution at -80 °C.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	표면적 25 cm², 경사진 넥, 캡 (플러그 씰)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		도립 현미경 및 카메라
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48웰 (뚜껑 포함 TC 처리됨)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	셀룰로오스 아세테이트 막, 공극 크기 0.45 μm, 막 면적 54.5 cm², 필터 용량 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	100 mM로 수령하여 멸균수로 10 mM로 희석
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphate buffered saline
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ 매미충 배지 성분
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ 매미충 배지 성분
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ 매미충 배지 성분
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ 매미충 배지 성분
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ 매미충 배지 성분
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ 매미충 배지 성분
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ 매미충 배지 성분
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ 매미충 배지 성분
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ 매미충 배지 성분
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ 매미충 배지 성분
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	H2G+ 매미충 배지 성분
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ 매미충 배지 성분
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ 매미충 배지 성분