전사 인자를 위한 농축 렌티바이러스 패키징 시스템의 구축 농축 바이러스의 생산(그림 1A, B) 1.1.1 1.5 × 10⁶ 개의 HEK(인간 배아 신장)-293T 세포를 60 mm 디시에 분주하고, 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 일반 배지(표 1 참조)와 함께 배양한다. 참고: 바이러스를 배치 단위로 패키징해야 하는 경우 100 mm 세포 배양 디시를 사용할 수 있다(자세한 내용은 표 2 참조). 1.1.2 24시간 후, 형질전환 당일에 HEK-293T 세포가 80-90%의 합류도(confluence)에 도달했는지 확인하고, 배지를 3.5 mL의 DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)(1 cm²당 DMEM 150 µL)으로 교체한다. 세포를 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 2시간 동안 둔다. 참고: 플라스미드 형질전환 효율을 높이기 위해 세포를 "기아 상태(starved)"로 만들어야 하므로, 교체 배지는 무혈청 배지여야 한다. 1.1.3 Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 또는 Snai2 타겟 플라스미드 3 µg, 패키징 플라스미드 PMD2.G 1 µg, 패키징 플라스미드 PSPAX2 2 µg을 포함하는 플라스미드 혼합액(혼합액 A)을 준비한다. 무혈청 DMEM을 사용하여 혼합액 A의 부피를 150 µL로 맞춘다. 형질전환 시약 12 µL(모든 플라스미드의 총 질량의 2배 부피)를 추가하여 형질전환 시약 혼합액(혼합액 B)을 준비하고, 무혈청 DMEM을 사용하여 혼합액 B의 부피를 150 µL로 맞춘다. 참고: 혼합액을 준비할 때 기포가 생기지 않도록 액체를 천천히 추가하는 것이 중요하다. 1.1.4 실온에서 5분 동안 방치한 후 혼합액 A와 혼합액 B를 결합한다. 형질전환 복합체를 형성시키기 위해 혼합액을 실온에서 20-30분 동안 배양한다. 1.1.5 배양기에서 HEK-293T 세포를 꺼내 배지를 DMEM + 2% FBS(태아 송아지 혈청)로 교체하고, 단계 1.1.4의 혼합액을 한 방울씩 떨어뜨려 추가한 후 액체를 부드럽게 섞어준다. 1.1.6 8시간 후, 배지를 3.5 mL의 일반 배지로 교체한다. 배지를 교체한 후, 24시간 및 48시간마다 바이러스 상청액을 수집한다. 1.1.7 서로 다른 두 시점에서 수집한 바이러스 상청액을 혼합한다. 4 °C에서 200 × g로 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 0.45 µm 필터로 여과하여 50 mL 멸균 원추형 튜브에 수집한다. 참고: 24시간에 수집한 바이러스는 4 °C에 보관했다가 48시간에 수집한 바이러스와 혼합할 수 있다. 1.1.8 4 °C에서 하룻밤(~16시간) 동안 6000 × g로 원심분리하여 바이러스 상청액을 농축한다. 원심분리 후 원추형 튜브 바닥에 바이러스 펠릿이 보이는지 확인한다. 1.1.9 상청액을 천천히 따라낸다. 바이러스 상청액 부피의 1/100에 해당하는 부피의 일반 배지로 바이러스 펠릿을 용해한다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 균질한 혼합물이 얻어질 때까지 부드럽게 파이펫팅한다. 농축된 바이러스를 필요에 따라 마이크로원심분리 튜브에 나누어 담는다. -80 °C에서 보관한다. 참고: 이 방법으로 바이러스가 100배 농축된다. 농축된 바이러스(100x)는 -80 °C에서 1년 이상 보관 가능하다. 바이러스의 반복적인 동결-융해를 피하라. 표 1: 일반 배지 및 재프로그래밍 배지의 성분 성분 | 용량(농도, 부피) | 최종 농도 일반 배지 (100 mL) | | DMEM/HIGH GLUCOSE | 89 mL | 열불활성화 FBS | 10 mL | 항생제(Pen/Strep) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL 재프로그래밍 배지 (100 mL) | | RPMI-1640 | 88 mL | 열불활성화 FBS | 10 mL | 재조합 인간 SCF | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL 재조합 인간 bFGF | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL 재조합 인간 인슐린 | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL EDN3 human | 100 μM, 100 μL | 0.1 μM 콜레라 독소 | 0.3 mg/mL, 0.56 μL | 20 pM Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM 하이드로코티손 | 100 μg/mL, 500 μL | 0.5 μg/mL 아데닌 | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL 표 2: 렌티바이러스 패키징 시스템의 세부 사항 배양 디시 | 분주 밀도(cells/dish) | 배지 (mL) | 플라스미드 시스템 | 형질전환 시약 (µL) | 타겟 플라스미드 (μg) | PMD2.G (μg) | PSPAX2 (μg) 35 mm | 6 × 10⁵ | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 60 mm | 1.5 × 10⁶ | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 100 mm | 4 × 10⁶ | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 Zhang, Y., 등마우스 섬유아세포의 멜라닌 세포로의 직접 재프로그래밍. J. Vis. Exp. (2021)
이 영상에서는 포유류 세포 내 재조합 렌티바이러스의 생산 및 농축 방법을 시연하며, 이를 통해 세포 리프로그래밍, 기능 연구 및 잠재적 치료 연구와 같은 응용 분야를 위한 전사 인자 또는 기타 유전 요소의 효율적인 유전자 전달이 가능해집니다.
