전사 및 복제 능력을 갖춘 바이러스 유사 입자(trVLP)의 초기 생산을 위한 생산 세포의 형질전환 세포 분할 24시간 후(실험 일정 개요는 그림 1 참조), 필터 팁을 사용하여 플라스미드 DNA(양은 표 1 참조)를 멸균된 2 mL 크라이오바이알에 피펫팅합니다. DNA에 웰당 100 µL의 OptiMEM을 추가합니다. 혼합물을 짧게 볼텍싱하고 마이크로 원심분리기를 사용하여 튜브를 가볍게 스핀 다운합니다. 여러 웰에 동일한 플라스미드를 형질전환하는 경우, 여러 웰 분량의 마스터 믹스를 조제할 수 있습니다. 사용 전 Transit LT1 바이알을 짧게 볼텍싱합니다. 희석된 DNA에 웰당 7.5 µL의 Transit LT1을 추가합니다. 크라이오바이알 뚜껑에 액체가 맺히지 않도록 주의하며 혼합물을 가볍게 볼텍싱하고, 실온에서 15분 동안 배양합니다. 피펫팅으로 형질전환 복합물을 부드럽게 섞습니다. 각 웰에 형질전환 복합물 100 µL를 한 방울씩 떨어뜨려 추가합니다. 형질전환 복합물을 분산시키기 위해 플레이트를 앞뒤 및 좌우로 흔들어 줍니다. 플레이트를 회전시키면 형질전환 복합물이 불균일하게 퍼질 수 있으므로 주의하십시오. 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 24시간 후, 세포에서 상층액을 제거합니다. 5% FBS(태아 송아지 혈청), 2 mM L-glutamine, 1x pen/strep(페니실린/스트렙토마이신)이 포함된 4 mL DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM5)을 세포에 추가합니다. 웰에 동일한 샘플이 들어 있다고 가정할 때, 웰이 마르지 않도록 한 번에 최대 3개의 웰까지 이 단계를 수행할 수 있습니다(그렇지 않은 경우, 이 시스템 내 trVLP(전사 및 복제 능력을 갖춘 바이러스 유사 입자)의 자가 증폭 특성으로 인해 교차 오염 문제가 발생할 수 있으므로, 이 단계는 한 번에 하나의 웰씩 수행해야 합니다). 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 표 1. 형질전환을 위한 DNA 양. 생산 세포 및 표적 세포의 형질전환에 필요한 각 플라스미드의 양을 6-웰 플레이트의 웰당 ng 단위로 나타냈습니다. | | 생산 세포 (p0) | 표적 세포 (p1 및 그 이상) | | :--- | :--- | :--- | | pCAGGS-NP | 125 | 125 | | pCAGGS-VP35 | 125 | 125 | | pCAGGS-VP30 | 75 | 75 | | pCAGGS-L | 1,000 | 1,000 | | p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - | | pCAGGS-T7 | 250 | - | | pCAGGS-Tim1-2 | 50 | - | Hoenen, T., 등. 테트라시스트론성 미니게놈을 포함하는 바이러스 유사 입자를 이용한 생물안전 2등급 조건에서의 에볼라 바이러스 생애 주기 모델링. J. Vis. Exp. (2014)
이 영상에서는 에볼라 바이러스 게놈을 모방한 tetracistronic 미니게놈 플라스미드를 헬퍼 플라스미드와 함께 인간 세포에 형질전환하는 방법을 보여줍니다. 세포 내부에서 바이러스 단백질과 루시퍼레이스가 발현되어, 비병원성이며 복제 능력을 갖춘 바이러스 유사 입자(virus-like particles)가 조립되고 출아하게 됩니다.
