인간 배아 신장 세포 내 항바이러스 화합물 평가를 위한 루시페라아제 기반 분석법

초록

1. 반딧불이 루시페레이스(firefly luciferase)를 발현하는 홍역 바이러스(rMV2/Luc) 감염 세포 배양 준비 안정화된 L-글루타민이 포함되고 10% 소태아혈청(FCS), 스트렙토마이신(100 μg/ml) 및 페니실린(100 IU/ml)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 HEK-293T 세포를 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양한다. 세포는 4-5일마다 트립신 처리를 통해 계대 배양하며, 새 플라스크에 1:10 비율로 희석하여 접종한다. 실험 시 세포는 대수 성장기에 있어야 한다. 실험 당일, 트립신 처리를 통해 세포를 회수하고 세포 수를 측정한다. 원심 분리로 세포 펠렛을 형성한 후, 배양액에서 3 x 10^5 cells/ml 농도로 재부유시킨다. 각 스크리닝 플레이트당 12.5 ml의 세포 현탁액이 필요함을 고려한다. 다시, 배양액에서 세포를 3 x 10^5 cells/ml 농도로 재부유시킨다. 각 스크리닝 플레이트당 12.5 ml의 세포 현탁액이 필요함을 고려한다. 선택 사항: 배양액에 20 μg/ml의 우리딘(uridine)을 첨가한다. 참고: 바이러스 복제 억제제를 찾기 위해 화합물 라이브러리를 스크리닝할 때, 피리미딘 생합성 경로의 초기 단계를 표적으로 하는 화합물이 빈번하게 분리되는 것으로 보인다. 배양액에 우리딘을 첨가하는 것은 이러한 항바이러스 분자들을 걸러내기 위함이다. 실제로 이는 피리미딘 생합성 경로의 상위 효소가 차단되었을 때 바이러스 복제를 효율적으로 복구시킨다. 세포 현탁액의 1/10은 비감염 세포 대조군 웰을 위해 남겨두고, 나머지 부피로 감염을 진행한다. 적절한 부피의 rMV2/Luc 스톡 용액을 해동한다. MV 스톡 용액은 통상적으로 ml당 10^6-10^8개의 감염성 입자를 포함한다. 배양 세포는 표적 세포당 0.1개의 rMV2/Luc 감염성 입자로 감염시켜야 하며, 이는 0.1의 감염 다중도(MOI)에 해당한다. 참고: rMV2/Luc는 MV 백신(Schwarz strain)에서 유도되었으며 BSL2 환경에서 취급한다. 바이러스를 세포 현탁액에 넣고 부드럽게 혼합한다. 감염된 세포를 트러프(trough)로 옮기고, 스파이킹된 화합물이 포함된 D2 플레이트의 2~11열에 감염된 세포 현탁액 100 μl를 분주한다. 트러프 내의 세포 현탁액은 주기적으로 부드럽게 혼합한다. 1열과 12열의 각 웰에는 비감염 세포 100 μl를 분주한다. 나머지 웰에는 감염된 세포를 분주한다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다. 2. 독성 및 광범위 항바이러스 활성 2차 스크리닝 각 히트 화합물을 디메틸설폭사이드(DMSO) 내에서 500 µM부터 4 µM까지 1:2 연속 희석(8단계 희석)한다. 바코드가 부착된 흰색 조직 배양 플레이트에 배양액 50 µl를 채운다. 배양 웰에 각 화합물 희석액 1 µl를 첨가한다. 이를 두 번 반복하여 히트 화합물당 중복 연속 희석이 포함된 3개의 배양 플레이트를 준비한다. 위에서 설명한 방법(1.1 및 1.2)대로 배양액에서 6 x 10^5 cells/ml 농도의 HEK-293T 세포 현탁액 37.5 ml를 준비한다. Falcon 튜브에 12.5 ml씩 2개를 분주하고, MOI = 0.1의 rMV2/Luc 또는 Renilla 루시페레이스를 발현하는 재조합 치쿤구니야 바이러스(CHIKV/Ren)를 MOI = 0.2로 감염시킨다. 도립 혼합하여 섞는다. 참고: CHIKV/Ren은 CHIKV 야생형 균주에서 유도되었으므로 BSL3 환경에서 취급해야 한다. Renilla 기질이 배양 웰에 첨가된 후에는 플레이트를 BSL3에서 BSL1로 이동시킬 수 있다(아래 참조). 히트 화합물의 연속 희석액이 담긴 배양 플레이트에 비감염 세포, rMV2/Luc 감염 세포 또는 CHIKV/Ren 감염 세포를 50 µl씩 분주한다. 37 °C에서 24시간 동안 배양한다. rMV2/Luc 감염 웰의 반딧불이 루시페레이스 활성을 측정하기 위해 반딧불이 루시페레이스 기질 50 µl를 첨가한다. CHIKV/Ren 감염 웰의 Renilla 루시페레이스 활성을 측정하기 위해 Renilla 루시페레이스 기질 50 µl를 첨가한다. 마지막으로, 비감염 세포에 루시페레이스 기반 생존능 측정 시약 50 µl를 첨가하여 세포 생존능을 측정한다. 데이터를 도식화(그림 1)하고 MV 및 CHIKV 복제를 50% 억제하는 히트 화합물 농도를 결정한다. 이 분석에서 독성을 보이는 화합물은 제외한다. Lucas-Hourani, M. 외. RNA 바이러스의 광범위 화학적 억제제 발굴을 위한 고속 스크리닝 J. Vis. Exp. (2014)

이 영상은 재조합 홍역 바이러스에 감염된 인간 배아 신장 세포를 이용한 루시페라아제 기반 항바이러스 분석법을 보여줍니다. 이 분석법은 연속 희석된 시험 화합물이 바이러스 복제를 억제하여, 숙주 세포의 생존능은 유지하면서 농도 의존적으로 발광 강도가 감소함을 보여줍니다.

프로토콜

1. 반딧불이 루시페라아제(firefly luciferase)를 발현하는 홍역 바이러스(MV, rMV2/Luc)에 감염된 세포 배양 준비

1. 안정화된 L-glutamine이 포함되고 10% fetal calf serum (FCS), streptomycin (100 μg/ml) 및 penicillin (100 IU/ml)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 HEK-293T 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 배양한다. 세포는 4-5일마다 트립신화(trypsinization)를 통해 계대 배양하며 새 플라스크에 1:10으로 희석한다. 실험을 위해 세포는 로그 성장기(log phase) 상태여야 한다.
2. 실험 당일, 트립신화로 세포를 회수하고 세포 수를 측정한다. 원심분리로 세포를 펠렛화한 후, 배양액에서 3 x 10⁵ cells/ml 농도로 재현탁한다. 각 스크리닝 플레이트당 12.5 ml의 세포 현탁액이 필요함을 고려한다.
3. 다시 한번, 배양액에서 세포를 3 x 10⁵ cells/ml 농도로 재현탁한다. 각 스크리닝 플레이트당 12.5 ml의 세포 현탁액이 필요함을 고려한다.
4. 선택 사항: 배양액에 20 μg/ml의 uridine을 첨가한다.
   참고: 바이러스 복제 억제제를 찾기 위해 화학 라이브러리를 스크리닝할 때, 피리미딘 생합성 경로의 초기 단계를 표적으로 하는 화합물이 빈번하게 분리되는 것으로 보인다. 배양액에 uridine을 첨가하는 것은 이러한 항바이러스 분자들을 걸러내기 위함이다. 실제로 이는 피리미딘 생합성 경로의 상위 효소들이 차단되었을 때 바이러스 복제를 효율적으로 회복시킨다.
5. 세포 현탁액의 1/10은 비감염 세포를 이용한 대조군 웰을 위해 남겨두고, 나머지 부피로 감염을 진행한다.
6. 적절한 부피의 rMV2/Luc 스톡 용액을 해동한다. MV 스톡 용액은 통상적으로 ml당 10⁶-10⁸ infectious particles 농도이다. 배양물은 표적 세포당 0.1 infectious particles의 rMV2/Luc로 감염시켜야 하며, 이는 0.1 multiplicity of infection (MOI)에 해당한다. 
   참고: rMV2/Luc는 MV 백신(Schwarz strain)에서 유래되었으며 BSL2 환경에서 취급한다.
7. 바이러스를 세포 현탁액에 첨가하고 부드럽게 섞는다. 감염된 세포를 트로프(trough)로 옮기고, 화학 화합물이 분주된 D2 플레이트의 2번에서 11번 컬럼에 감염된 세포 현탁액 100 μl를 분주한다. 트로프 내의 세포 현탁액은 주기적으로 부드럽게 섞어준다.
8. 1번과 12번 컬럼의 각 웰에는 비감염 세포 100 μl를 분주한다. 나머지 웰에는 감염된 세포를 분주한다.
9. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다.

2. 독성 및 광범위 항바이러스 활성에 대한 2차 스크리닝

1. 각 히트 화합물을 dimethylsulfoxide (DMSO)로 500 µM에서 4 µM까지 1:2 연속 희석(8단계 희석)합니다. 바코드가 부착된 흰색 조직 배양 플레이트에 배양액 50 µl를 채웁니다. 배양 웰에 각 화합물 희석액 1 µl를 첨가합니다. 이를 두 번 반복하여 각 히트 화합물에 대해 이중 연속 희석이 포함된 배양 플레이트 3개를 준비합니다.
2. 앞서 설명한 방법(1.1 및 1.2)에 따라 배양액 내 6 x 10⁵ cells/ml 농도의 HEK-293T 세포 현탁액 37.5 ml를 준비합니다. Falcon 튜브에 12.5 ml씩 2개로 나누어 담고, 세포를 MOI = 0.1의 rMV2/Luc 또는 MOI = 0.2의 Renilla luciferase 발현 재조합 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV/Ren)로 감염시킵니다. 튜브를 뒤집어 섞습니다.
   참고: CHIKV/Ren은 CHIKV 야생형 균주에서 유래하였으므로 BSL3 환경에서 취급해야 합니다. 배양 웰에 Renilla 기질을 첨가한 후에는 플레이트를 BSL3에서 BSL1로 이동할 수 있습니다 (아래 참조).
3. 히트 화합물이 연속 희석된 배양 플레이트에 비감염, rMV2/Luc 감염 또는 CHIKV/Ren 감염 세포 50 µl를 분주합니다. 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.
4. rMV2/Luc 감염 웰의 firefly luciferase 활성을 측정하기 위해 firefly luciferase 기질 50 µl를 첨가합니다. CHIKV/Ren 감염 웰의 Renilla luciferase 활성을 측정하기 위해 Renilla luciferase 기질 50 µl를 첨가합니다. 마지막으로, 비감염 세포에 luciferase 기반 생존능 분석 시약 50 µl를 첨가하여 세포 생존능을 측정합니다.
5. 데이터를 도식화(그림 1)하고 MV 및 CHIKV 복제를 50% 억제하는 히트 화합물의 농도를 결정합니다. 이 분석에서 어느 정도의 독성을 보이는 화합물은 제외합니다.

결과

그림 1. 화합물 C864, C648 및 C062의 용량 반응 항바이러스 활성 및 독성. (A) HEK-293T 세포를 루시페라아제를 발현하는 MV의 rMV2/Luc 균주(MOI=0.1)로 감염시키고, C864, C648, C062 또는 DMSO 단독으로 농도를 높여 배양하였다. 24시간 후 루시페라아제 발현을 측정하였다. *은 세 가지 화합물 모두에서 관찰된 루시페라아제 억제가 통계적으로 유의미함(p-values < 0.05)을 나타낸다. (B) HEK-293T 세포를 Renilla 루시페라아제를 발현하는 CHIKV의 CHIKV/Ren 균주(MOI=0.2)로 감염시키고, C864, C648, C062 또는 DMSO 단독으로 농도를 높여 배양하였다. 24시간 후 Renilla 루시페라아제 발현을 측정하였다. *은 세 가지 화합물 모두에서 통계적으로 유의미한 억제(p-values < 0.05)가 나타났음을 의미한다. (C) HEK-293T 세포를 C864, C648, C062 또는 DMSO 단독으로 농도를 높여 배양하였다. 독성 대조군으로서 세포 배양액에 0.5% IGEPAL 용액 2.5 μl를 첨가하였다. 24시간 후, 루시페라아제 기반 생존력 분석법을 사용하여 살아있는 세포 수를 측정하였다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Freedom EVO 플랫폼	TECAN		로봇 플랫폼
96-웰 폴리스티렌 세포 배양 마이크로플레이트, 백색	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo 발광 세포 생존능 분석 키트	Promega	G7570	루시페레이스 기반 생존능 분석
Bright-Glo 루시페레이스 분석 시스템	Promega	E2610	반딧불이 루시페레이스 기질 포함 시약
Renilla-Glo 루시페레이스 분석 시스템	Promega	E2710	Renilla 루시페레이스 기질 포함 시약
Britelite plus 리포터 유전자 분석 시스템	Perkin-Elmer	6016761	반딧불이 루시페레이스 기질 포함 시약. 루시페레이스 활성 측정을 위해 Bright-Glo 시약의 대안으로 사용할 수 있음.