아메바를 이용한 혼합 바이러스 집단으로부터 단일 거대 바이러스의 분리

초록

출처: Sahmi-Bounsiar, D. et al. 거대 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성 세포 분류법의 대안 전략으로서의 단일 세포 미세 흡입법. J. Vis. Exp. (2019)

이 영상에서는 아메바를 호스트 세포로 사용하여 혼합 바이러스 집단으로부터 단일 거대 바이러스 집단을 분리하고 증식시키기 위한 단일 세포 미세 흡입법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 아메바 배양

1. 사용법 Vermamoeba vermiformis (strain CDC19)을 세포 지지체로 사용한다.
2. 30 mL의 프로테아제-펩톤-효모 추출물-포도당 배지(PYG)를 추가합니다(표 1) 및 1 x 10 농도의 아메바 3 mL⁶ 75 cm² 플라스크 내 mL당 세포 수² 세포 배양 플라스크.
3. 배양물을 다음 조건에서 유지하십시오. 28 °C.
4. 48시간 후, 계수 슬라이드를 사용하여 아메바의 양을 정량한다.
5. 세척을 위해, 1 x 10^6 cells/mL 농도로 세포를 회수하십시오.⁶ cells/mL 농도로 맞춘 후, 720 x g에서 10분간 원심분리하여 아메바를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고, 1 x 10 농도를 얻기 위해 적절한 부피의 기아 배지에 펠렛을 재현탁합니다.⁶ cells/mL (표 1).

2. 한계 희석

1. 기아 배지(표 1)를 사용하여 바이러스 샘플을 단계 희석(10^-1에서 10^-11)합니다.
2. 각 페트리 접시에 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis 2 mL를 접종하고, 혼합 접종액 100 µL를 첨가합니다.
3. 페트리 접시를 밀봉 가능한 플라스틱 백에 넣어 30 °C에서 배양합니다.
4. 감염 후 6시간부터 도립 광학 현미경으로 페트리 접시 관찰을 시작하고, 4~8시간마다 세포 형태를 확인합니다.
5. 세포가 둥글게 변하는 세포병성 효과가 나타나면, 단일 세포 미세 흡입 과정을 시작합니다.

3. 단일 세포 미세 흡입

1. 숙주 준비
   참고: 이 준비 과정은 감염된 단일 세포를 새로운 세포 지지체로 방출하기 위해 수행됩니다.
   1. 배양 중인 아메바를 10 µg/mL vancomycin, 10 µg/mL imipenem, 20 µg/mL ciprofloxacin, 20 µg/mL doxycycline 및 20 µg/mL voriconazole를 포함하는 항균제로 처리합니다. 이 혼합물은 박테리아 및 진균 오염을 방지하기 위해 사용됩니다.
      참고: 이 절차는 미생물 안전 작업대 외부의 벤치에서 진행됩니다. 1 x 10⁶ cells/mL로 농축된 아메바 2 mL를 15개의 Petri dish에 각각 분주합니다. 아메바의 부착을 위해 배양물을 30 °C에서 30분 동안 배양합니다.
2. 한계 희석(limit dilution)을 통해 다음 기준에 따라 미세 흡입(micro-aspiration)에 사용할 Petri dish를 선택합니다: 1) 진균 및 박테리아에 의한 가시적인 오염이 없을 것, 2) 바이러스로 인한 아메바의 세포병성 효과(cytopathic effect) 증거가 있을 것, 3) 아메바의 사전 용해 및 원형화 단계(viral particles의 흡입을 피하기 위함)에 있을 것.
3. 다음 재료들을 사용하여 워크스테이션을 설정합니다 (그림 1A,B): 마이크로피펫의 위치 조절이 가능한 마이크로매니퓰레이터(Micromanipulator); 세포를 마이크로피펫 내부로 흡입하고 방출하는 데 사용되는 수동 압력 조절 장치; 도립 현미경; 플러그 앤 플레이(Plug and play) 모터 모듈; 카메라; 조작 과정을 시각화하고 사진을 촬영하기 위한 컴퓨터 모듈.
4. 마이크로피펫을 선택합니다 (그림 1C).
   참고: 세포의 크기, 세포막의 변형 및 표면 부착 정도, 세포 운동성은 미세 흡입의 원활한 진행에 영향을 줄 수 있습니다. 마이크로피펫의 직경은 세포의 크기와 흡입 방법에 따라 특정 세포 유형에 맞게 정밀하게 선택하고 조정할 수 있습니다. 원형의 아메바(직경 ~10 µm)를 흡입하기 위해 내경 20 µm의 마이크로피펫을 사용하였습니다. 이를 통해 세포를 내부에 유지하고 쉽게 방출할 수 있습니다.
5. 시스템을 장착합니다.
   1. 전동 모듈의 그리핑 시스템 작동 각도를 45°로 고정합니다.
   2. 먼저 그리핑 시스템에, 그다음 마이크로피펫에 이중 설치를 수행합니다.
   3. 마이크로피펫을 통해 오일 몇 방울을 흘려보낸 후 세포에 초점을 맞춥니다.
      참고: 생체 적합성 미네랄 오일은 장치에서 공급됩니다.
   4. 제조사의 권장 사항에 따라 장착을 완료합니다.
6. 세포 클로닝 (그림 2A,B)
   1. 감염된 아메바 2 mL가 들어 있는 Petri dish를 현미경 아래에 놓습니다.
   2. 먼저 세포에 초점을 맞춘 다음, 배양액에 잠긴 마이크로피펫에 초점을 맞춥니다.
   3. 원형의 단일 세포를 선택하고 마이크로매니퓰레이터를 이용하여 마이크로피펫을 가까이 가져갑니다.
   4. 수동 압력 조절을 통해 세포에 부드럽게 흡입력을 가하여 마이크로피펫 내부로 끌어들입니다. 첫 번째 샘플에서 단일 세포를 제거하여 세포 지지체에 방출한 후, 30 °C에서 배양합니다.
   5. 도립 광학 현미경을 사용하여 매일 관찰함으로써 세포의 외형을 확인하고 세포병성 효과의 출현을 모니터링합니다.

표 1: 배양 배지의 조성

결과

그림 1: 미세조작 장비. (A) 워크스테이션의 실제 설정 모습. (B) 워크스테이션 구성 요소의 모식도. (C) 미세모세관의 모식도.)

그림 2: 미세 흡입 단계. (A) 단일 세포 분리 과정 (40배 확대). (B) 단일 세포 흡입의 각 단계에 대한 모식도: 1) 세포 위치 확인. 2) 세포 흡입. 3) 방출 단계. 검은색 화살표는 미세모세관을, 흰색 화살표는 단일 세포를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Corning cell culture flasks 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	배양
Corning cell culture flasks 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	배양
Corning cell culture flasks 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	배양
DFC 425C camera	LEICA	Unkown	관찰/모니터링
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	Unkown	관찰/모니터링
Microcapillary 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	세포의 미세흡입 및 방출
Micromanipulator InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	미세모세관 위치 제어
Petri dish 35 mm	Ibidi	81158	배양/관찰