유전체 분석을 위한 개별 바이러스 입자의 형광 기반 분리

초록

출처: Zeigler Allen, L., et al. 'Single Virus Genomics'를 이용한 단일 비리온의 분리 및 게놈 분석. J. Vis. Exp. (2013).

이 영상에서는 형광 기반 검출과 정밀한 입자 분류를 통해 혼합 집단으로부터 게놈을 포함하는 개별 바이러스를 분리하고, 이후 게놈 특성 분석을 위해 아가로스에 매립하는 유세포 분석법의 과정을 보여줍니다.

프로토콜

1. 바이러스 현탁액 준비

유세포 분석법을 통한 단일 비리온 분리 전, 고정되지 않은 바이러스 현탁액을 준비합니다.

1. 기존에 확립된 프로토콜을 사용하여 바이러스 입자를 분리하고, 최종 바이러스 현탁액이 0.1 μm 필터 처리된 TE (Tris-EDTA, pH 8)에 포함되도록 합니다. 화학적 응집을 사용하는 다른 방법들이 개발되었으나, 접선 흐름 여과(TFF) 방식의 사용을 권장합니다.
2. 에피형광 현미경 8-10 또는 유세포 분석기 등 확립된 프로토콜을 사용하여 바이러스 입자의 수를 측정합니다.
3. 바이러스 현탁액을 두 개의 Eppendorf 튜브에 소분합니다 (최종 부피는 1,000 μl를 권장합니다).

2. 유세포 분석법

1. 커스텀 전방 산란 PMT(FSC PMT)가 장착된 BD FACSAria II 유세포 분석기를 사용하여 바이러스를 분리하려면, 0.1 μm 여과된 TE(pH 8.0)로 바이러스 입자를 희석하여 이벤트 발생률이 200 events sec^-1이 되도록 적절한 역가로 맞춥니다.
2. 신호 대 잡음비를 최대화하도록 임계값을 설정합니다. 예를 들어, T4 및 람다 파지 입자가 포함된 혼합 집합체의 경우 FSC PMT 1,000 및 SSC 200을 권장합니다.
3. 1) 0.1 μm 여과된 TE와 2) 0.1 μm 여과된 TE 및 스톡(10,000X)을 1e-4로 희석한 SybrGreen1만을 포함하는 "블랭크" 샘플 100 μl를 분석합니다.
4. 배경 값을 평가하기 위해 염색되지 않은 바이러스 현탁액의 소량 분주액(100 μl 권장)을 분석한 다음, 염색된 바이러스 현탁액(스톡을 1e-4로 희석한 SybrGreen1)을 분석하며, 바이러스 입자당 총 5,000 이벤트가 될 때까지 진행합니다. 이는 분리 전 농도를 확인하고 필요한 경우 분리 게이트를 조정하기 위함입니다. 바이러스 입자의 중심부에 좁은 게이트를 설정하는 것을 권장합니다. 또한, 게이트를 생성할 때는 SYBR Green 및 FSC PMT 플롯을 사용합니다.
5. 37 °C로 냉각된 1% 저융점(LMP) 아가로스(TBE 버퍼 내) 5 μl를 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 현미경 슬라이드(Electron Microscopy Sciences)의 각 웰에 추가합니다.
6. 분리된 바이러스 입자를 포집하기 위해 PTFE 현미경 슬라이드를 유세포 분석기에 로드합니다.
7. SYBR green으로 염색된 바이러스 입자를 LMP 아가로스가 도포된 PTFE 슬라이드로 직접 분리하기 시작합니다. 공초점 레이저 주사 현미경(CSLM) 관찰 시 바이러스의 깊이 검출을 용이하게 하기 위해 일부 웰에는 10개 이상의 이벤트(바이러스 입자)를 분리하는 것을 권장합니다.
8. 분리가 완료되면 유세포 분석기에서 슬라이드를 제거하고, 각 웰에 37 °C로 냉각된 LMP 아가로스 5 μl를 추가로 넣어 바이러스 입자를 매립합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1X TE 버퍼	Invitrogen	12090-015
버퍼 포화 페놀	Invitrogen	15513-039
LMP 아가로스	Invitrogen	16520100
PTFE 현미경 슬라이드	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 웰, 직경 4 mm
β-agarase	New England Biolabs	M0392S