본 영상에서는 후속 검출 및 분석을 가능하게 하기 위해 아메바 기반 공동 배양을 이용하여 환경수 샘플로부터 거대 바이러스를 농축하는 방법을 보여줍니다.
방법 논문
환경 수질 시료로부터 거대 바이러스의 아메바 기반 농축
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2026년 9월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 시료 수집
- 다양한 환경과 지역에서 70개의 샘플을 수집합니다. 이 경우에는 다음을 사용하십시오: 프랑스 Saint Pierre de Meyzoargues 마을의 오염된 물 샘플 5개, 프랑스 마르세유 Parc Borély 호수 샘플 15개, 프랑스 마르세유 Samena의 암석 해안 입구에서 채취한 퇴적물이 포함된 해수 샘플 15개, 프랑스 알프스의 강물 샘플 25개, 마지막으로 프랑스 La Ciotat의 하수 샘플 10개.
- 접종 전 샘플을 균질화하기 위해 별도의 처리 없이 실온에서 1분 동안 볼텍싱(vortex)합니다.
2. 분리 절차
- 맹검 배양 절차를 위한 숙주 준비 및 시료 접종
- 공동 배양을 위한 세포 지지체로 Vermamoeba vermiformis(균주 CDC19)를 사용한다.
- 아메바를 28 °C에서 30 ml의 protease-peptone-yeast extract-glucose 배지(PYG)가 담긴 75 cm2 세포 배양 플라스크에서 유지한다. PYG 조성은 표 1을 확인한다.
참고: 48시간 후, 계수 슬라이드(예: Kovaslides)를 사용하여 일반 계수법으로 아메바 양을 측정한다. - 5 x 105 ~ 106 cells/ml 농도로 세포를 수확하고, 720 x g에서 10분간 원심분리하여 아메바 펠렛을 형성한다.
- 흡입법으로 상층액을 제거하고, 표 1의 멸균 Page's amoebal saline(PAS) 30 ml에 아메바 펠렛을 재현탁한다. 이 세척 과정을 반복한다.
- 약 106 amoeba/ml 농도로 항생제 및 항진균제 혼합물이 포함된 기아 배지 30 ml에 아메바를 재현탁한다. 기아 배지는 아메바가 포자 형성이나 증식 없이 생존할 수 있게 하는 생존 배지이다. 조성은 표 1을 확인한다.
참고: 항균제 혼합물은 10 µg/ml vancomycin, 10 µg/ml imipenem, 20 µg/ml ciprofloxacin, 20 µg/ml doxycycline, 20 µg/ml voriconazole를 포함한다. 이 혼합물은 바이러스 증식을 감소시키거나 변화시킬 수 있는 박테리아 및 진균 오염을 줄이는 역할을 한다. - 아메바 부착에 유리한 96-well flat bottom 플레이트의 200 µl 아메바 단층 위에 각 시료 25 µl를 직접 접종하고, 습윤 환경(증발을 방지하기 위해 플레이트가 담긴 백 내부에 젖은 압축 솜을 배치한 상태)에서 30 °C로 배양한다. 이것이 1차 배양(primo-culture)이다. 두 개의 웰에는 시료를 접종하지 않고 아메바만 둡니다. 이는 음성 대조군으로 작용한다. 이 1차 배양을 3일간 진행한다.
- 1차 접종 3일 후, 현미경 관찰 없이 앞서 설명한 방식대로 1차 배양 플레이트를 새로운 아메바에 계대 배양한다. 새 플레이트를 1차 배양과 동일한 조건에서 3일간 배양한다.
- 3일간의 배양이 끝난 후, 1차 및 계대 배양과 동일한 방식으로 최종 배양을 수행한다. 최종 배양을 2일간 진행한 다음 검출 단계로 넘어간다.
표 1. 용액 레시피
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Protease-peptone-yeast extract-glucose (PYG) 배지, Page's amoebal saline (PAS), 기아 배지(Starvation medium) | 자체 실험실 제조 | Marseille URMITE | x |
| 아메바 균주 CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| 플레이트 | Cellstar | France | 655180 |
| 플라스크 | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 초원심분리기 Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
