형광 현미경을 이용한 감염성 C형 간염 바이러스의 정량 분석

초록

출처: Ren, S., et al. C형 간염 바이러스 복제 분석 프로토콜. J. Vis. Exp. (2014)

이 영상에서는 세포 배양 내의 감염성 C형 간염 바이러스를 정량화하는 데 사용되는 형광 포커스 분석법(fluorescence focus assay)을 보여줍니다. 바이러스 상층액의 단계적 희석, 간암 세포의 감염, 그리고 항체 기반 형광 현미경을 이용한 바이러스 복제 부위의 검출 과정을 설명합니다.

프로토콜

1. 바이러스 역가 측정

1. 96-well 플레이트를 사용하여 naive Huh-7.5.1 세포를 웰당 약 3 x 10³ cells/well 밀도로 분주합니다. 다음 날, 성장 배지를 사용하여 C형 간염 바이러스(HCV) RNA가 형질전환된 세포에서 수확한 세포 없는 배양 상층액을 10배 단계 희석하고, 이를 Huh-7.5.1 세포에 3반복으로 접종합니다.
2. 감염 후 72시간에 메탄올을 사용하여 세포를 고정하고(-20 ºC에서 30분 동안), HCV NS5A 단백질에 대해 면역 염색을 수행합니다.
3. 세포를 PBS로 3회 세척하고 IFA 블로킹 버퍼로 블로킹합니다.
4. 토끼 항-NS5A 다클론 1차 항체 또는 마우스 항-dsRNA 단클론 항체 J2를 1:200 (1 μg/ml)로 희석하여 처리하고 4 ºC에서 5시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.
5. 1차 항체 처리 후 세포를 PBS로 3회 세척합니다.
6. 염소 항-토끼 IgG-488 다클론 2차 항체 또는 염소 항-마우스 IgG-594 다클론 2차 항체를 1:1,000 (1 μg/ml)으로 희석하여 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
7. 세포를 PBS로 3회 세척하고 형광 현미경으로 관찰합니다.
8. 가장 높은 희석 배수에서 NS5A 양성 포커스(foci) 수를 측정하여 밀리리터당 평균 포커스 형성 단위(FFU) 수를 계산합니다. HCV 타이터는 Figure 1을 참조하십시오.

결과

그림 1. 야생형 HCV의 감염성 조사 및 바이러스 역가 측정. A) 감염 연구를 위해 나이브 Huh-7.5.1 세포를 사용하였다. HCV RNA 트랜스펙션 후 48시간 및 96시간(hpt)에 수집한 세포 제거 상층액을 10배 단계 희석하여 96-well 플레이트의 세포에 3반복으로 첨가하였다. 감염 72시간 후, 세포를 고정하고 HCV NS5A 단백질에 대해 면역 염색을 수행하였다. NS5A 양성 염색(빨간색)이 나타난 세포는 바이러스에 감염된 것이다. Focus Forming Unit (FFU)를 평가하기 위해, 가장 높은 희석 배수에서의 양성 포커스 수를 측정하였다. 대표 이미지 패널이 제시되었다 (스케일 바 100 μm). B) 밀리리터당 FFU 단위의 바이러스 역가 평균값과 표준 편차가 그래프에 표시되어 있다. 폴리머라제 결손 돌연변이체는 감염성 입자를 생성하지 않았다. WT: 야생형; Pol-: 폴리머라제 결손.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		해당 세포주는 The Scripps Research Institute와 Cedars-Sinai Medical Center 간에 체결된 MTA에 따라 Dr. Francis Chisari가 Dr. Arumugaswami에게 제공함
Mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020