바이러스 감염 세포의 전사 억제 시각화

초록

출처: Kalveram, B. et al. 클릭 화학을 이용한 바이러스 감염이 숙주 세포 RNA 합성에 미치는 영향 측정. J. Vis. Exp. (2013)

본 영상에서는 클릭 화학(click chemistry)과 형광 현미경을 사용하여 포유류 세포 내 신생 RNA 전사를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 감염된 세포와 대조군 세포 간의 형광 신호를 비교함으로써, 바이러스 감염이 어떻게 숙주 전사를 억제하는지를 강조하여 설명합니다.

프로토콜

1. Rift Valley fever virus (RVFV) MP-12 균주로 세포를 감염시키고 5-ethynyl uridine (EU)로 신생 RNA를 표지함

   1. 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 성장 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM))가 담긴 6-well 조직 배양 플레이트에 분주한다. 세포의 합쳐짐(confluency)이 80 - 100%에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO₂ 습윤 배양기에서 배양한다.
   2. 감염 다중도(MOI) 3으로 MP-12를 사용하여 세포를 감염시킨다. 감염되지 않은 well을 최소 두 개 포함해야 한다. 두 well 중 하나는 비감염 대조군으로 사용하고, 다른 하나는 actinomycin D (ActD)를 처리한다. 성장 배지를 제거하고 바이러스 stock을 희석하여 각 well에 추가되는 총 부피가 400 μL가 되게 한다. 37 °C, 5% CO₂ 습윤 배양기에서 1시간 동안 배양한다.
   3. 접종액을 제거하고 well당 2 mL의 신선한 성장 배지를 추가한다. 37 °C에서 12시간 동안 배양한다.

   참고: 이 프로토콜을 다른 바이러스에 적용하는 경우, 표지 및 수확을 위한 최적의 시점을 결정하기 위해 시간 경과 실험을 수행하는 것이 권장된다. 감염 시간을 엇갈리게 설정하여 모든 샘플을 동시에 표지, 수확 및 염색할 수 있도록 시간 경과 실험을 구성한다.

   4. 감염 후 12시간(hpi)에 성장 배지를 0.5 mM EU가 포함된 배지로 교체한다. 모의 감염(mock-infected)된 well 중 하나에 5 μg/mL ActD를 추가한다. ActD는 DNA 의존성 RNA 합성을 억제하므로, 이는 전사 억제에 대한 대조군 역할을 한다. 세포를 다시 배양기에 넣는다.
   5. 감염 후 13시간(hpi)에 phosphate-buffered saline (PBS)로 세포를 1회 세척하고 트립신 처리(trypsinization)를 통해 세포를 수확한다. 수확한 세포를 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)가 포함된 PBS로 3회 세척한다.

   참고: 이 단계 및 후속 단계에서 세포 파괴를 방지하기 위해 500-1,000 x g보다 빠르게 원심 분리하지 마십시오. 세포를 침전시키기 위해 1-2분 동안 원심 분리한다.

   참고: 클릭 반응 후 표면 면역 염색을 계획하고 있다면, 대신 고무 폴리스맨(rubber policeman)이나 일회용 세포 스크래퍼를 사용하여 수확한다.

   6. 세포를 1 mL의 4% paraformaldehyde (PFA)에 재현탁하여 고정하고 실온(RT)에서 30분 동안 배양한다.
   7. well당 1 mL PBS-EDTA로 1회 세척한다. 즉시 단계 2로 진행한다.

   참고: 이 단계에서 장시간 방치하면 RNA가 변성되므로 즉시 클릭 반응을 진행하는 것이 중요하다. 마찬가지로 시간 경과 실험을 수행하는 경우, 모든 샘플을 동시에 표지, 고정 및 염색해야 한다.

2. 표지된 RNA 검출을 위한 클릭 반응

   1. PBS에 0.2% Triton X-100을 1 ml 첨가하여 세포를 투과화한다. 실온(RT)에서 10분 동안 배양한다.

   참고: 단계 2.1에서 2.3까지 사용되는 모든 용액은 nuclease-free여야 한다.

   2. well당 1 ml PBS로 3회 세척한다.
   3. 12-well 플레이트에서 커버슬립을 제거하여 습윤 챔버로 옮긴다. 각 커버슬립을 50 - 100 μl 클릭 염색 용액(100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO₄, 20 μM 형광 아지드 [최대 여기/방출 파장: 590/617 nm], 100 mM ascorbic acid)으로 덮는다. 암실의 실온(RT)에서 1시간 동안 배양한다.

   참고: 습윤 챔버를 구성하려면, 직경 10 cm의 세포 배양 접시 또는 페트리 접시 바닥에 플라스틱 파라핀 필름을 깐다. 접시 가장자리 안쪽에 젖은 종이 타월을 댄다. 플라스틱 파라핀 필름 위에 커버슬립을 놓는다.

   참고: 이 단계나 프로토콜의 다른 단계 중에 커버슬립이 마르지 않도록 주의한다. 커버슬립을 습윤 챔버에 놓은 직후에 염색 용액을 추가하는 것이 가장 좋다.

   참고: 클릭 염색 용액은 이 단계 직전에 신선하게 준비한다. 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄, 500 mM ascorbic acid의 stock 용액은 4 °C에서 보관할 수 있다. 단, 노란색으로 변한 ascorbic acid stock 용액은 폐기한다.

   참고: 사용하는 형광 현미경의 필터와 일치하는 형광체를 선택해야 한다.

   4. 커버슬립을 습윤 챔버에서 꺼내어 새 12-well 플레이트에 놓고 well당 1 ml PBS로 3회 세척한다.
   5. 현미경 슬라이드 위에 Fluoromount-G 한 방울(약 15 μl)을 떨어뜨려 커버슬립을 마운트한다. 커버슬립을 H₂O에 담근 후, 옆면을 종이 타월에 대어 과잉 H₂O를 제거하고, 세포 면이 아래로 향하게 하여 Fluoromount-G 방울 위에 놓는다. 5분 동안 자연 건조시킨다.

   참고: 도립 현미경으로 이미징하는 경우, Fluoromount-G를 4 °C에서 하룻밤 동안 굳히거나 투명 매니큐어로 가장자리를 밀봉하여 커버슬립을 현미경 슬라이드에 고정한다.

   참고: 슬라이드는 즉시 이미징하거나 4 °C 암실에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-Ethynyl uridine	Berry Associates	PY 7563	100 mM 스톡 용액을 위해 DMSO에 용해
12-mm 원형 커버슬립	Fisherbrand	12-545-82
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	10 mM 스톡 용액을 위해 DMSO에 용해
형광 현미경			예: Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	100 mM 스톡 용액을 위해 H₂O에 용해
DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)	Invitrogen	11965092
FBS (Foetal bovine serum)	Invitrogen	16000044
형광 아지드 (Alexa Fluor 594 결합)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	500 mM 용액을 위해 H₂O에 용해
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma base	Sigma	T-1503	1.5 M 스톡 용액을 위해 H₂O에 용해, pH 8.5