유세포 분석법을 이용한 바이러스 유도 숙주 전사 억제 분석

초록

출처: Kalveram, B., et al. 클릭 화학을 이용한 바이러스 감염이 숙주 세포 RNA 합성에 미치는 영향 측정. J. Vis. Exp. (2013)

본 영상에서는 클릭 화학(click chemistry)과 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용하여 바이러스로 인해 유도된 숙주 세포 전사 억제 정도를 측정하는 방법을 보여줍니다. 포유류 세포에 숙주 전사 인자 복합체를 교란하는 핵 병원성 단백질을 발현하는 바이러스를 감염시키며, 대조군 세포는 전사 활성을 유지하도록 합니다. 5-ethynyl uridine을 통합시켜 새롭게 합성된 mRNA를 표지함으로써, 이중 형광 검출을 통해 감염 세포와 대조군 세포의 전사 활성을 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

1. MP-12를 이용한 세포 감염 및 5-ethynyluridine (EU)을 이용한 신생 RNA 표지

1. 성장 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin 함유 DMEM)가 담긴 6-well 조직 배양 플레이트에 293 세포를 분주합니다. 세포가 80 - 100% 밀도(confluency)에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO₂ 조건의 가습 배양기에서 배양합니다.
2. m.o.i. 3로 MP-12를 세포에 감염시킵니다. 이때 감염시키지 않은 well을 최소 두 개 포함합니다. 이 중 하나는 비감염 대조군으로 사용하고, 다른 하나는 단계 1.4에서 ActD로 처리합니다. 성장 배지를 제거하고 바이러스 스톡을 희석하여 각 well에 추가되는 총 부피가 400 μl가 되도록 합니다. 37 °C, 5% CO₂ 조건의 가습 배양기에서 1시간 동안 배양합니다.
3. 접종액을 제거하고 well당 2 ml의 신선한 성장 배지를 추가합니다. 37 °C에서 12시간 동안 배양합니다.

참고: 본 프로토콜을 다른 바이러스에 적용하여 사용하는 경우, 라벨링 및 수확의 최적 시점을 결정하기 위해 시간 경과 실험(time course experiment)을 수행하는 것이 좋습니다. 감염 시간을 서로 다르게 설정하여 모든 샘플을 동시에 라벨링, 수확 및 염색할 수 있도록 시간 경과 실험을 구성하십시오.

4. 감염 후 12시간(h.p.i.)에 성장 배지를 0.5 mM EU가 포함된 배지로 교체합니다. 모의 감염(mock infected) 웰 중 하나에 5 μg/ml ActD를 추가합니다. ActD는 DNA 의존적 RNA 합성을 억제하므로, 이는 전사 억제 대조군으로 사용됩니다. 세포를 인큐베이터로 옮깁니다.
5. 감염 후 13시간(h.p.i.)에 세포를 PBS로 한 번 세척하고 트립신화를 통해 세포를 수확합니다. 수확한 세포를 1 mM EDTA가 포함된 PBS(PBS-EDTA)로 세 번 세척합니다.

참고: 본 단계 및 이후 단계에서는 세포 파손을 방지하기 위해 500 - 1,000 x g보다 빠른 속도로 세포를 원심분리하지 마십시오. 세포를 침전시키기 위해 1-2분 동안 원심분리하십시오.

참고: 클릭 반응 후 표면 면역염색을 계획 중이라면, 대신 고무 폴리스맨(rubber policeman)이나 일회용 세포 스크래퍼(cell scraper)를 사용하여 수확하십시오.

6. 세포를 4% PFA 1 ml에 다시 부유시켜 고정하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
7. 웰당 1 ml의 PBS-EDTA로 한 번 세척합니다. 즉시 6단계로 진행하십시오.

주의: RNA는 이 단계에서 장시간 방치될 경우 분해되므로, 즉시 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 시간 경과 실험(time course experiment)을 수행하는 경우 모든 샘플의 라벨링, 고정 및 염색을 동시에 진행하십시오.

2. 표지된 RNA 검출을 위한 클릭 반응

1. PBS에 0.2% Triton X-100을 포함한 용액 0.5 ml에 세포를 재부유하여 투과화합니다. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.

참고: 단계 2.1에서 2.3까지 사용되는 모든 용액은 뉴클레이스 프리(nuclease free) 상태여야 합니다. 이 단계에서 세포가 제대로 침전되지 않으면 원심분리 시간을 5 min으로 늘리십시오. FACS buffer에 세포를 부유시키면 침전 거동이 개선될 것입니다.

2. 1 ml PBS로 한 번 세척합니다.

주의: 이 단계에서는 EDTA를 사용하지 마십시오. EDTA는 클릭 반응에 필요한 Cu²⁺ 이온을 킬레이트화합니다.

3. 200 μl의 클릭 염색 용액(100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 형광 염료가 결합된 200nM azide [최대 흡수/방출 파장: 650/665 nm], 100 mM ascorbic acid)에 세포를 재부유합니다. 암실 상태의 RT에서 1시간 동안 배양합니다.

참고: 클릭 염색 용액은 이 단계 직전에 신선하게 준비하십시오. 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄, 그리고 500 mM ascorbic acid의 스톡 용액은 4 °C에서 보관할 수 있습니다. 다만, 노란색으로 변한 ascorbic acid 스톡 용액은 폐기하십시오. 이 단계에서 세포가 뭉치는 경우, 피펫팅을 여러 번 반복하여 다시 현탁하십시오. 사용 중인 유세포 분석기로 검출 가능한 형광체를 선택해야 합니다. 또한, 클릭 염색 과정을 거치지 않은 감염 세포 샘플을 하나 준비하십시오. 이는 유세포 분석기의 보정에 필요합니다. 감염된 세포의 절반을 사용하거나, 단계 1.2에서 감염 웰을 추가로 포함하십시오.

FACS 버퍼(1 mM EDTA와 0.5% (w/v) BSA가 포함된 PBS)로 2회 세척합니다.

3. 바이러스 단백질 발현 검출을 위한 면역형광법

1. FACS buffer에 희석한 1차 항체(anti-RVFV, 1:10,000) 200 μl에 세포를 재현탁하고, 암조건의 RT에서 1시간 동안 배양한다.

참고: 또는, 이 단계는 4 °C의 암소에서 하룻밤(O/N) 동안 수행할 수 있습니다.

참고: 클릭 염색 과정은 거치되 면역 염색은 수행하지 않는 비감염 세포 샘플을 하나 더 준비하십시오. 이 샘플은 유세포 분석기의 교정에 필요합니다. 모의 감염 세포의 절반을 사용하거나, 단계 1.2에서 비감염 웰을 하나 더 추가하십시오.

주의: 이 프로토콜을 다른 바이러스에 적용할 때는 먼저 1차 항체의 최적 희석 배수를 결정하십시오.

2. FACS 버퍼로 세포를 2회 세척합니다.
3. FACS 버퍼에 희석한(1:1,000) 200 μl의 2차 항체(형광 염료가 결합된 anti-mouse IgG [최대 흡수/방출 파장: 495/519 nm])에 세포를 재부유시키고, 암실 상태의 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
4. FACS 버퍼로 세포를 1회 세척합니다.

참고: 이 단계에서 세포를 4 °C 암소에 하룻밤(O/N) 동안 보관할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	100 mM 스톡 제작을 위해 DMSO에 용해
12-mm 원형 커버슬립	Fisherbrand	12-545-82
5 ml 폴리스티렌 튜브	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	10 mM 스톡 제작을 위해 DMSO에 용해
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	100 mM 스톡 제작을 위해 H2O에 용해
DAPI	Sigma	D-9542	5 mg/ml 스톡 제작을 위해 H2O에 용해
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
형광 아자이드 (Alexa Fluor 594 결합)	Invitrogen	A10270
형광 아자이드 (Alexa Fluor 657 결합)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	500 mM 제작을 위해 H2O에 용해
종이 필터	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	1.5 M 스톡 제작을 위해 H2O에 용해, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
형광 현미경			예: Olympus IX71
유세포 분석기			예: BD Biosciences LSRII Fortessa