레트로바이러스 생산 1.1. Bosc23 세포의 단일 세포 현탁액(6 × 10⁶)을 16 cm 페트리 접시에 도말하고, 배양 합류도가 80%에 도달할 때까지(24시간) 10% FBS(소태아혈청)가 함유된 18 mL의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양한다. 참고: 세포는 배양 시 덩어리를 형성하지 않고 단층으로 성장해야 한다. 세포 계수는 다양한 방법으로 수행할 수 있으며(이후에 제시되는 나머지 프로토콜에도 적용됨), 샘플 수가 적은 경우에는 Bürker 챔버를 이용한 현미경 하 수동 계수를 권장한다. 이 경우, 사멸 세포를 배제하기 위해 Trypan blue를 사용한다. 세포를 PBS(인산염 완충 식염수) 내 0.4% Trypan Blue와 1:1로 혼합한다. 대량의 샘플을 계수하려면 자동 세포 계수기를 사용할 수 있다. 1.2. 40 µg의 레트로바이러스 컨스트럭트(예: MSCV), 20 µg의 pCL-Eco(패키징 벡터), 80 µl의 PEI(polyethylenimine), 그리고 2 mL의 저혈청 배지(예: 항생제가 없는 Opti-MEM (Minimum Essential Medium))를 혼합한다. 이 혼합물을 실온(RT)에서 20분 동안 배양한다. 1.3. Bosc23 세포 배지를 2% FBS가 보충된 16 mL DMEM으로 조심스럽게 교체한다. 배지는 사용 전 37 °C로 예열한다. 참고: 항생제는 형질전환 효율을 감소시킬 수 있으므로 형질전환 과정 중에는 사용하지 않는다. 1.4. 1.2단계에서 준비한 혼합물을 Bosc23 배양액에 천천히 한 방울씩 조심스럽게 첨가하고, 37 °C에서 4시간 동안 배양한다. PEI 독성으로 인해 배양 시간은 6시간 미만으로 제한한다. 1.5. 배양 후, Bosc23 배지를 10% FBS가 함유된 예열된 18 mL DMEM으로 교체하고, 37 °C에서 48시간 동안 세포를 배양한다. 접시는 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실에 두고 표준 안전 절차를 따른다. 1.6. 25 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 Bosc23 배지(에코트로픽 레트로바이러스 입자 함유)를 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하여 4 °C에서 보관한다. 참고: (중요) 고역가 바이러스를 생산하려면 형질전환 효율이 90%에 도달해야 한다. 1.7. Bosc23 세포에 예열된 18 mL DMEM 10% FBS를 첨가하고 24시간 동안 배양한다. 1.8. 1.6단계를 반복한다. 참고: 바이러스의 무결성을 보존하기 위해 1.6단계와 1.8단계의 레트로바이러스 상층액은 동일한 온도(4 °C)에 도달했을 때 합칠 수 있다. 1.9. 바이러스 상층액의 Bosc23 오염을 방지하기 위해, 수집한 바이러스를 4 °C에서 1500 × g로 10분 동안 원심 분리한다. 바이러스를 소분하여 드라이아이스나 액체 질소를 이용해 급속 냉동한 후 -80 °C에서 보관한다. 단, 갓 준비한 바이러스가 냉동 보관된 스톡보다 감염 효율 측면에서 품질이 더 높다는 점에 유의한다. 참고: (중요) 바이러스의 반복적인 냉동/해동은 바이러스 분해를 초래하므로 피해야 한다. Zjablovskaja, P., et a생쥐 골수성 전구 세포 32D/G-CSF-R의 증식 및 분화. J. Vis. Exp. (2018)
이 영상에서는 인간 신장 유래 패키징 세포를 형질전환하여 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는 과정을 보여주며, 이를 통해 유전자 변형, 기능 분석 또는 계통 분화 연구와 같은 후속 응용 분야를 위한 표적 세포로의 안정적인 유전자 전달이 가능해집니다.
