재조합 바이러스의 회수 및 1차 계대 참고: 다음의 모든 단계는 2급 생물안전작업대 내의 무균 환경에서 수행하십시오. 1.1. 형질전환 전날, BSRT7/5 세포주를 완전 배지에서 5 x 10⁵ cells/mL 농도로 현탁액을 만듭니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 2 mL씩 분주합니다. 회수할 바이러스당 하나의 웰을 준비하고, 음성 대조군용으로 웰 하나를 추가로 준비합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 다음 날 세포의 합쳐짐(confluence) 정도가 80%~90%인지 확인합니다. 1.2. 역유전학적 호흡기세포융합바이러스(RSV) 벡터인 p-RSV-GFP 및 p-RSV-M2-1-GFP와 p-N, p-P, p-L, p-M2-1을 해동합니다. 회수할 각 바이러스에 대해 p-N과 p-P 각 1 µg, p-L 0.5 µg, p-M2-1 0.25 µg, p-RSV(GFP 또는 M2-1 GFP) 1.25 µg을 튜브에 혼합합니다. 참고: 폴리머라제 복합체 바이러스 단백질(N, P, L, M2-1)에 대해 다른 발현 벡터를 사용할 수 있으나, 단백질 간의 비율은 유지되어야 합니다. p-RSV 벡터를 빈 벡터로 교체하여 음성 대조군 실험을 수행합니다. 1.3. 형질전환을 진행합니다(재료 표 참조). 1.3.1. 혼합된 벡터에 저혈청 배지 250 µL를 추가합니다. 다른 튜브에 형질전환 시약 10 µL를 저혈청 배지 250 µL에 희석합니다. 두 튜브를 모두 부드럽게 볼텍싱하고 5분간 대기합니다. 두 튜브의 내용물을 혼합하고 상온에서 20분간 대기합니다. 1.3.2. BSRT7/5 세포를 저혈청 배지 1 mL로 세척하고, 항생제가 없는 10% 소태아혈청(FCS) 함유 최소 필수 배지(MEM) 1.5 mL를 각 웰에 분주합니다. 필요한 경우, 단계 1.3.1의 배양 과정이 완료될 때까지 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 1.3.3. 20분의 배양 시간이 지나면 단계 1.3.1에서 준비한 형질전환 혼합액 500 µL를 웰에 추가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 3일 동안 배양합니다. 형질전환 기간 동안 세포의 배양액을 교체하지 마십시오. 1.4. GFP 필터를 사용하여 도립 형광 현미경 하에서 20배 배율로 하루에 한 번 녹색 형광 단백질(GFP) 형광(들뜸 파장 488 nm, 방출 파장 515-535 nm)을 관찰하여 회수 효율을 모니터링합니다. Bouillier, C. 외.재조합 호흡기 세포융합 바이러스의 복구, 증폭 및 역가 측정. J. Vis. Exp. (2019)
이 비디오에서는 T7 기반 역유전학 시스템을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스를 생성하는 과정을 보여줍니다. 바이러스 단백질을 인코딩하는 플라스미드와 GFP 태그가 붙은 게놈을 공동 형질전환하면 단백질 발현이 유도되고 바이러스 구조(rescue)가 시작됩니다.
