감염성 호흡기 세포융합 바이러스 정량을 위한 플라크 역가 측정법

초록

출처: Bouillier, C., et al. 재조합 호흡기 세포 융합 바이러스의 생성, 증폭 및 역가 측정. J. Vis. Exp. (2019)

이 영상에서는 상피세포 단일층 내의 감염성 재조합 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 정량화하는 데 사용되는 플라크 역가 측정법을 보여줍니다. 연속 희석된 바이러스 현탁액을 이용한 숙주 세포 감염, 셀룰로오스 기반의 반고체 오버레이를 통한 바이러스 확산 억제, 그리고 세포병성 효과로 인한 국소적 플라크 형성 과정을 제시합니다. 이 절차는 염색, 오염 제거 및 플라크 수를 세는 것으로 마무리되며, 이를 통해 바이러스 역가를 결정하고 RSV 감염성을 평가합니다.

프로토콜

1. 플라크 역가 측정법

1. 정량 분석 전날에 정량 분석용 12-웰 플레이트를 준비하십시오 (바이러스 1튜브를 정량하는 데 6개의 웰이 필요합니다). 각 웰에 5 x 10^5 cells/mL 농도의 인간 상피 세포 2형(HEp-2) 세포 1 mL를 분주하십시오. × 10⁵ 완전 배지 내 cells/mL
2. 다음 날, 멸균된 미세결정성 셀룰로오스 현탁액(물에 2.4% [w/v])을 준비합니다(재료 표 참조).
   1. 표준 마그네틱 교반기를 사용하여 미결정성 셀룰로오스 분말 2.4g을 증류수 100mL에 분산시키고, 분말이 완전히 용해될 때까지 교반한다(통상 4~12시간 소요). 이 현탁액을 다음과 같이 오토클레이브로 멸균한다. 121 °C 20분 동안 두고, 사용 전까지 실온에서 보관하십시오.
      참고: 이러한 조건 하에서, 현탁액은 1년 동안 안정적입니다.
   2. 멸균 환경에서 용액을 개봉한 후, 다음 온도에서 보관하십시오. 4 °C 6개월 동안 보관하십시오. 균질한 상태를 유지하기 위해 사용 전에는 항상 (손으로 흔들거나 볼텍싱하여) 현탁액을 혼합하십시오.
3. 2를 준비합니다.× 멸균 환경에서 최소 필수 배지(minimum essential media, MEM)를 준비합니다. 시판 MEM을 10배 희석하십시오.× 멸균수로 희석하고 L-글루타민, 1,000 units/mL 페니실린 및 1 mg/mL 스트렙토마이신을 첨가합니다. 희석액을 격렬하게 흔들어 섞은 후 다음 온도에서 보관하십시오. 4 °C.
   참고: 2등급 안전 작업대(class II safety cabinet)를 사용하여 멸균된 환경에서 1.4~1.10단계를 수행하십시오.
4. 다음이 포함된 6개의 튜브를 준비하십시오. 900 µL 역가 측정 대상 바이러스당 소태아혈청(FCS)이 포함되지 않은 MEM을 (역가 측정 튜브에) 분주합니다. 바이러스 분주액을 해동하고 5초간 강하게 볼텍싱한 후, 이를 옮깁니다. 100 µL 첫 번째 역가 측정 튜브에
5. 10배 희석을 수행하십시오 6×다음과 같이 수행합니다. 추가하십시오. 100 μL 바이러스의 900 μL 첫 번째 튜브에 배지를 넣고, 튜브 캡을 닫은 후 몇 초간 볼텍싱하여 내용물을 혼합합니다. 피펫 팁을 교체하고, 다음을 추가합니다. 100 µL 첫 번째 희석액의 900 µL 두 번째 튜브에 배지를 넣고, 튜브 캡을 닫은 후 볼텍싱합니다. 이 과정을 여섯 번째 튜브까지 반복합니다.
   참고: 각 희석 단계마다 팁을 교체하는 것이 매우 중요합니다.
6. HEp-2 12-웰 플레이트에 바이러스 이름과 희석 배수를 기입하십시오. 염색 과정(단계 1.9) 중에 플레이트와 커버가 분리될 수 있으므로, 서로 짝을 맞출 수 있도록 표시를 해 둡니다. 플레이트에서 배지를 제거하고 분주하십시오. 400 µL 웰당 하나의 희석액을 분주합니다. 플레이트를 다음 온도에서 배양합니다. 37 °C 바이러스 흡착을 위해 2시간 동안 배양합니다.
   참고: 접종원마다 피펫 팁을 교체하거나, 동일한 팁을 사용하여 최저 농도에서 최고 농도 순으로 진행하십시오. 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 소수의 플레이트(1~2개)를 동시에 접종하십시오.
7. 바이러스 흡착 과정 중에 미세결정성 셀룰로오스 오버레이를 준비하십시오(즉석 제조). 오버레이 100mL를 얻으려면, 2.4% 미세결정성 셀룰로오스 현탁액 10mL와 2%× MEM, 그리고 2% FCS가 포함된 MEM 80mL.
   1. 2의 pH를 조절합니다.× 색상 지시약을 확인하며 7.5% 멸균 탄산수소나트륨 용액으로 MEM의 pH를 약 7.2로 조정한다. 미세결정성 셀룰로오스 현탁액과 MEM을 첨가하고 격렬하게 혼합한다.
8. 2시간의 배양 후, 접종물을 제거하지 않은 상태에서 12-well 플레이트의 각 well에 2~3mL의 overlay를 첨가합니다. 이때 바이러스 역가가 높은 접종물이 인접한 well을 오염시키지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 다음 조건에서 배양합니다. 37 °C 및 5% CO2₂ 6일 동안 배양합니다. 배양하는 동안 플레이트와 인큐베이터를 이동하지 마십시오.
9. 크리스탈 바이올렛 용액(물에 8% 크리스탈 바이올렛 [v/v], 2% 포름알데히드 [v/v], 20% 에탄올 [v/v])을 사용하여 세포를 염색하십시오.
   1. 생물안전작업대(biosafety cabinet)의 작업 표면을 시트로 보호하십시오(크리스탈 바이올렛은 표면을 강하게 착색시킵니다).
   2. 플레이트를 부드럽게 흔들어 미세결정성 셀룰로오스 오버레이를 제거합니다. 상층액을 제거하고 세포를 2회 세척합니다.× 1과 함께× 인산완충생리식염수(PBS)로 세척합니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 플레이트를 하나씩 처리하십시오. 크리스탈 바이올렛 용액 1~2 mL를 첨가하고 10~15분 동안 기다립니다. 용액을 제거하며, 이 용액은 다음 플레이트 염색에 재사용할 수 있습니다.
   3. 플레이트와 덮개를 새 표백제에 몇 초 동안 담근 다음, 수돗물로 깨끗이 씻어냅니다. 플레이트와 덮개는 표백제에 의해 멸균 처리됨에 유의하십시오.
   4. 플레이트와 덮개를 종이 타월 위에 올려놓고 건조시킵니다. 수세 후 플레이트를 상온에서 건조하고 실온에 보관하십시오. 장기간(수개월) 보관할 경우, 색상 유지를 위해 플레이트를 빛으로부터 차단하여 보관하십시오. 세포의 색이 빠진 경우에는 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 다시 염색할 수 있습니다.
10. 바이러스 역가를 계산한다. 육안으로 확인 가능한 건조 플레이트 웰 내의 플라크 수를 측정한다. 각 희석 배수 간의 플라크 수가 일관적인지(각 희석 단계 간 10배 차이) 확인한다. 플라크 수를 가장 쉽게 측정할 수 있는 웰을 선택한다. 접종 부피 및 희석 배수 대비 플라크 수를 평가한다.
    참고: 제공된 예시의 그림 1, 10배 희석 배수에서 21개의 플라크가 계수되었습니다.^-5 희석. 이는 다음과 같은 역가에 해당합니다.

결과

그림 1: 플라크 분석법을 이용한 RSV 역가 측정. (A) 12-웰 플레이트에서 수행한 플라크 역가 측정 분석 결과. 하나의 바이러스 스톡을 연속 희석하여 감염시킨 6개의 웰을 보여준다. 희석 배수는 상용로그(base-10 logarithm)로 표시되었다. 처음 세 단계의 희석액으로 감염된 세포들은 모두 탈락되었다. 10^-4, 10^-5, 10^-6 희석액에서 관찰된 플라크 수는 일정하다. (B) 플라크 계수법(노란색 숫자)의 예시. 녹색 별표는 세포층의 긁힘 부분을 나타낸다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
크리스탈 바이올렛 용액	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), 글루타민 제외	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX 보충제	ThermoFisher Scientific	41090-028
중탄산나트륨 7.5% 용액	ThermoFisher Scientific	25080094
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122