세포 배양 상청액 내 역전사 효소(RT) 분석 방사성 물질 사용이 가능한 생물 안전 3등급(BSL-3) 시설 내에 생물 안전 작업대(biological safety hood)를 설치한다. 작업대 내에 흡수지를 배치하고, 흡입기를 방사성 물질 전용 흡입기로 교체한다. 참고: 모든 방사성 폐기물은 안전 규정에 따라 적절하게 처리해야 한다. RT 마스터 믹스(표 1 참조) 1ml 분주액 각각에 10 mCi/ml [α-33P] deoxythymidine triphosphate (dTTP) 1-2 µl와 1 M dithiothreitol (DTT) 4 µl를 첨가한다. RT 마스터 믹스, DTT, [α-33P] dTTP가 들어있는 각 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브를 1,000 µl 피펫으로 조심스럽게 혼합한 후, 멸균 트라프(trough)로 옮긴다. 96-웰 박벽 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 플레이트의 각 웰에 표지된 RT 믹스 25 µl를 분주한다. 참고: 양성 대조군(MJ4 야생형(WT) 감염)과 음성 대조군(모의 감염)을 위한 공간을 포함한다. RT 마스터 믹스가 들어있는 PCR 플레이트에 각 상청액 5 µl를 첨가한다. PCR 플레이트를 접착성 포일 커버로 밀봉하고 써모사이클러(thermocycler)에서 37 °C로 2시간 동안 배양한다. 안전을 위해 피펫 팁을 Amphyl로 헹구고, 나중에 방사성 폐기물로 처리할 Amphyl 폐기물이 담긴 작은 용기에 팁을 버린다. 배양 후, 200 µl 멀티채널 피펫을 사용하여 포일 커버에 작은 구멍을 낸다. 참고: 피펫 팁이 웰 내의 액체에 닿은 경우, 다음 열이나 행으로 이동하기 전에 팁을 교체한다. 샘플을 5회 혼합하고, 각 샘플 5 µl를 DE-81 종이에 옮긴다. 10분간 자연 건조시킨다. 블롯을 1x saline-sodium citrate (SSC)로 5회 세척하고, 이어서 90% 에탄올로 5분씩 2회 세척한다. 자연 건조시킨다. 각 블롯을 샌드위치 보관함과 같은 별도의 세척 용기에 넣고, 블롯이 잠길 정도로 충분한 세척 버퍼(1x SSC 또는 90% 에탄올(EtOH))를 추가한 후 5분 동안 흔들어준다. 세척 버퍼를 별도의 용기에 따라내고 이 과정을 반복한다. 참고: 처음 3회의 세척액은 방사성 물질로 간주하여 적절하게 처리해야 하며, 마지막 2회의 세척액은 일반 폐기물로 처리할 수 있다. 건조 후 블롯을 Saran wrap으로 조심스럽게 감싸고, 밀폐된 카세트 내의 포스포스크린(phosphoscreen)에 실온에서 밤새 노출시킨다. 포스포이미저(phosphorimager)로 포스포스크린을 분석하고 방사성 전사체를 정량화한다. OptiQuant 소프트웨어를 사용하여 각 방사성 신호 주위에 원을 그린다. Digital Light Unit (DLU) 값을 그래프로 나타내어 복제 곡선을 생성한다. 복제 능력 점수를 생성하기 위해 DLU 값을 log10 변환하고, 2일, 4일, 6일 시점을 사용하여 기울기를 계산한다. 이후 복제 기울기를 WT MJ4의 기울기로 나누어 복제 능력 점수를 산출한다. 분석 내 변동성을 줄이기 위해 동일한 RT 플레이트에서 얻은 MJ4 WT 값을 기준으로 정규화하는 것이 중요하다. 표 1: 방사성 표지 역전사 효소 분석 마스터 믹스 레시피. 참고: -20 °C에서 1 ml씩 분주하여 보관한다. 시약 / 부피 (ml) Nuclease-free H2O / 419.5 Tris-Cl, pH 7.8 (1 M) / 30 Potassium chloride (1 M) / 37.5 Magnesium chloride (1 M) / 2.5 Nonidet P-40 (10%) / 5 EDTA (0.5 M) / 1.02 Polyadenylic acid, potassium salt (2 mg/ml) / 1.25 Oligo-dT primer (25 μg/ml) / 3.25 총 부피 / 500 Claiborne, D. T. 외. 제한효소 기반 클로닝 방법을 이용한 분석 인 비트로(In vitro) HIV-1 서브타입 C Gag-MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력. J. Vis. Exp. (2014)
본 영상에서는 방사성 표지 역전사 효소 분석법을 이용한 바이러스 복제 능력 평가 방법을 시연합니다. 자손 비리온이 포함된 배양 상청액을 방사성 표지 뉴클레오타이드가 포함된 역전사 혼합액에 첨가합니다. 통합된 신호는 바이러스의 생성량과 복제 효율을 반영합니다. 포스포이미징을 사용하여 시험 시료와 야생형 시료 간의 신호를 검출하고 비교합니다.
