루시퍼레이즈 기반 바이러스 정량을 위한 시료 준비

초록

1. 시료 준비 역가 측정을 위해 루시페라아제 발현 바이러스(여기서는 VSV∆51-Fluc를 예로 듦)가 포함된 시료를 확보하여 96-웰 플레이트로 옮긴다. 또는 96-웰 조직 배양 플레이트에서 감염을 수행하고 상층액을 직접 사용한다. 표준 곡선을 포함시키기 위해 두 개 열은 처리하지 않고 둔다. 96-웰 플레이트에서 직접 실험을 수행하는 경우, 실험 종료 시점(감염 후 40시간)에 역가를 측정하거나 -80 °C에 보관했다가 추후에 역가를 측정한다. 2. 바이러스 역가 측정을 위한 허용 세포 준비 역가 측정 24시간 전에, 10% 태아 송아지 혈청(FBS), 30 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)에서 2.5 x 10⁵ cells/ml 농도의 Vero 세포 현탁액을 준비한다. 참고: 본 프로토콜에서는 Vero 세포를 사용하지만, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 감염에 적합한 모든 허용 세포주를 사용할 수 있다. 마이크로플레이트 디스펜서를 사용하여 96-웰 화이트 솔리드 평저 플레이트에 2.5 x 10⁴ cells (100 μl)를 분주한다. 플레이트당 12 ml의 세포 현탁액과 프라이밍용 5 ml를 추가로 준비한다. 50 ml의 멸균수로 튜빙을 세척하여 마이크로플레이트 디스펜서 카세트를 청소한다. 마이크로플레이트 디스펜서 라인에 세포 현탁액을 채우고, 5 ml의 세포 현탁액을 흘려보낸다. 화이트 벽 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 μl를 분주하는 프로그램을 선택한다. 분주하고, 추가 플레이트가 필요한 경우 이를 반복한다. 또한 불투명 바닥 화이트 벽 플레이트를 사용하는 경우, 세포 건강 상태와 밀도를 확인하기 위해 96-웰 투명 평저 플레이트의 몇 개 웰에도 세포를 분주한다. 작업이 끝나면 세포를 원래 용기로 다시 회수한다. 튜빙에 70% 에탄올 50 ml를 흘려보낸 후, 따뜻한 멸균수 50 ml를 흘려보내 카세트를 세척한다. 사용 사이에 카세트와 튜빙이 적절하게 세척되었는지 확인한다. 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37 °C로 24시간 동안 세포를 배양한다. 3. 바이러스 표준 곡선 준비 Vero 세포로 전이한 후 ml당 플라크 형성 단위(pfu)의 최종 농도가 다음과 같이 되도록 무혈청 DMEM에서 VSV∆51-Fluc의 표준 곡선을 준비한다: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml 및 10¹ pfu/ml. Vero 세포 플레이트당 각 농도별로 50 μl와 추가로 10%를 더 준비한다. 참고: 절대 정량이 가능한 표준 곡선을 생성하려면 클래식한 방법으로 루시페라아제 바이러스 스톡의 역가를 평가해야 한다. 그렇지 않으면, 희석 단계를 기반으로 바이러스 역가를 임의로 설정하여 정확한 역가 정보 없이 상대 정량을 수행할 수 있다. 예를 들어, 표준 곡선의 첫 번째 희석액을 10⁸ 바이러스 단위로 설정하고, 이어지는 1/10 희석액을 10⁷로 설정하는 식이다. 이 경우 절대 정량이 정확하지 않으므로, 미리 결정된 시료와 비교한 배수 변화(fold-change)로 값을 표현해야 한다. 4. 허용 세포로의 시료 상층액 전이 광학 현미경으로 투명 바닥 96-웰 플레이트에 분주된 Vero 세포를 관찰하여 단층이 최소 95% 합쳐졌는지(confluent) 확인한다. 화이트 벽 플레이트에 분주된 Vero 세포 위로 시료 상층액 25 μl를 전이한다. 표준 곡선용으로 지정된 2개 열에는 상층액을 전이하지 않는다. 참고: 96채널 액체 핸들러를 사용하면 단일 플레이트의 모든 웰에 대해 동시에 수행할 수 있다. 8채널 또는 12채널 멀티채널 피펫을 사용하여, 단계 3에서 준비한 표준 곡선의 각 희석액 25 μl를 지정된 2개 열의 Vero 세포에 첨가한다. 실온(RT)에서 430 x g로 5분간 플레이트를 원심분리한다. 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서 37 °C로 5시간 동안 배양한다. Garcia, V., 등루시페라아제 발현 재조합 바이러스의 고효율 적정법. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

본 영상에서는 루시퍼레이스 기반 분석법을 사용하여 바이러스 부하를 평가하기 위한 세포 배양 샘플 준비 과정을 보여줍니다. 여기서는 유전자 변형 바이러스로 상피 세포를 감염시키고, 바이러스 상층액과 표준 물질을 분석 웰로 옮긴 후, 원심분리와 배양을 통해 바이러스의 세포 내 진입을 촉진하는 과정을 설명합니다. 루시퍼레이스의 발현은 리포터 역할을 하여, 발광 신호 출력값에 근거해 바이러스 농도를 정량화할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 시료 준비

1. 적정(titration)을 위해 루시퍼레이스 발현 바이러스(본 예시에서는 VSV∆51-Fluc)가 포함된 샘플을 확보하여 96-웰 플레이트에 옮깁니다. 또는, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 감염을 수행하고 상층액을 직접 사용합니다.
2. 표준 곡선 삽입을 위해 두 개 열은 처리하지 않은 상태로 둡니다. 96-웰 플레이트에서 직접 수행한 실험의 경우, 실험 종료 시(감염 후 40시간)에 적정하거나 -80 °C에 보관 후 나중에 적정합니다.

2. 바이러스 역가 측정을 위한 감수성 세포 준비

1. 타이터 측정 24시간 전에 10% fetal bovine serum (FBS), 30 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 및 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)에서 Vero 세포 현탁액을 2.5 x 10⁵ cells/ml 농도로 준비한다. 
   참고: 본 프로토콜에서는 Vero 세포를 사용하지만, vesicular stomatitis virus (VSV) 감염에 적합한 다른 허용 세포주를 사용할 수 있다.
2. 마이크로플레이트 디스펜서를 사용하여 96-well 화이트 솔리드 평저 플레이트에 2.5 x 10⁴ cells (100 μl)를 분주한다.
   1. 플레이트당 12 ml의 세포 현탁액과 프라이밍을 위한 5 ml를 추가로 준비한다.
   2. 튜브에 50 ml의 멸균수를 흘려보내 마이크로플레이트 디스펜서 카세트를 세척한다.
   3. 마이크로플레이트 디스펜서 라인을 세포 현탁액으로 채우고 5 ml의 세포 현탁액을 흘려보낸다.
   4. 화이트 벽 96-well 플레이트의 각 웰에 100 μl를 분주하는 프로그램을 선택한다. 분주를 수행하며, 추가 플레이트가 필요한 경우 이를 반복한다. 또한, 불투명 바닥의 화이트 벽 플레이트를 사용하는 경우 세포 상태와 밀도를 확인하기 위해 96-well 투명 평저 플레이트의 몇몇 웰에도 세포를 분주한다.
   5. 완료 후, 세포를 원래 용기로 다시 흘려보낸다. 튜브에 50 ml의 70% ethanol을 흘려보낸 후, 50 ml의 따뜻한 멸균수를 흘려보내 카세트를 세척한다.
   6. 사용 간에 카세트와 튜브가 적절하게 세척되었는지 확인한다.
3. 습윤 5% CO₂ 배양기에서 37 °C로 24시간 동안 세포를 배양한다.

3. 바이러스 표준 곡선 준비

1. Vero 세포에 접종한 후 ml당 plaque forming units (pfu)의 최종 농도가 다음과 같이 되도록 무혈청 DMEM에서 VSV∆51-Fluc 표준 곡선을 준비한다: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml, 및 10¹ pfu/ml. Vero 세포 플레이트당 각 농도별로 50 μl를 준비하며, 여기에 10%의 여유분을 추가한다.
   참고: 절대 정량이 가능한 표준 곡선을 생성하려면 luciferase 바이러스 스톡의 타이터를 전통적인 방식으로 평가해야 한다. 그렇지 않을 경우, 희석 단계를 기반으로 바이러스 타이터를 임의로 설정함으로써 정확한 타이터 정보 없이도 상대 정량을 수행할 수 있다. 예를 들어, 표준 곡선의 첫 번째 희석액을 10⁸ 바이러스 단위로 설정하고, 이어지는 1/10 희석액을 10⁷로 설정하는 식이다. 이 경우 절대 정량은 정확하지 않으므로, 미리 결정된 샘플과 비교한 배수 변화(fold-change)로 값을 표현해야 한다.

4. 시료 상청액의 허용 세포 전이

1. 광학 현미경으로 투명 바닥 96-well 플레이트에 분주된 Vero 세포를 관찰하여 단일층이 최소 95% 합류(confluent)되었는지 확인한다.
2. 흰색 벽 플레이트에 분주된 Vero 세포 위에 샘플 상층액 25 μl를 옮긴다. 표준 곡선용으로 지정된 2개 열에는 상층액을 옮기지 않는다. 
   참고: 96채널 액체 핸들러를 사용하면 단일 플레이트의 모든 웰에 대해 동시에 수행할 수 있다.
3. 8채널 또는 12채널 멀티 채널 피펫을 사용하여, 단계 3에서 준비한 표준 곡선의 각 희석액 25 μl를 지정된 2개 열의 Vero 세포에 첨가한다.
4. 실온(RT)에서 430 x g로 5분 동안 플레이트를 원심 분리한다.
5. 습도가 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 37 °C로 5시간 동안 배양한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
태아 송아지 혈청	NorthBio Inc.	NBSF-701
인산염 완충 식염수	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	1 mM 용액, pH 7.3로 준비
96-well 고체 백색 평저 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트	Corning	3917	더 높은 처리량을 위해 384-well 플레이트도 사용 가능
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	단색화 장치 마이크로플레이트 리더
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	96 팁 수동 피펫팅 시스템
필터가 포함된 멸균 Liquidator96 LTS 팁	Mettler Toledo	LQR-200F	선택한 피펫터와 호환되는 모든 멸균 필터 팁 사용 가능
Microflo	BioTek	111-206-21	96-well 플레이트에 세포를 분주하는 데 사용
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	마이크로플레이트 형광 측정계