마우스 배아줄기세포(mESC)의 렌티바이러스 감염 저계대(passage 35 미만)의 피더-프리 적응 chromatin in vivo assay(CiA) mESC를 20% ESC 등급 소태아혈청(FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES), 1x 비필수 아미노산(NEAA), Pen/Strep, 2-mercaptoethanol 및 1:500 백혈병 억제 인자(LIF)가 첨가된 고농도 포도당 Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM) 기본 배지에서 5% CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터 내에 배양한다. 참고: LIF는 Lif-1C-alpha를 생성하는 Cos 세포(COS LIF)의 상층액에서 얻으며, 이를 배치 단위로 수집하여 -80 °C에 냉동 보관한다. 1x 인산 완충 식염수(PBS)에 0.1% 젤라틴으로 1~3시간 동안 사전 배양한 후 1x PBS로 세척한 플레이트에서 세포를 배양한다. 세포의 밀도에 따라 매일 배지를 교체하고 2~3일마다 계대 배양한다. 참고: 형태학적으로 배아줄기세포(ES) 콜로니는 크기가 작고 둥글며 서로 명확히 구분되어야 한다. 감염 1일 전에 mESC를 12-웰 플레이트 형식(웰당 100,000개 세포)으로 계대 배양한다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정한다. 10-cm 플레이트에서 배양한 세포의 경우, 기존 배지를 흡입하여 제거하고 1x PBS 5 mL를 첨가한 뒤 다시 흡입하여 제거하고, 0.25% 트립신 1 mL를 첨가한다. 37 °C에서 8분 동안 트립신 처리하며, 배양 중간에 플레이트를 흔들거나 쳐준다. 이 단계의 목적은 세포를 단일 세포 현탁액 상태로 만드는 것이다. 15-cm 플레이트의 293T 인간 배아 신장(HEK) 세포의 배지를 교체한 지 48시간 후에 상층액을 제거하여 50-mL 원추형 튜브로 옮긴다. 상층액을 300 x g에서 5분 동안 원심 분리하여 세포 잔해를 침전시킨다. 상층액을 0.45-µm 멤브레인으로 여과한다. 참고: 일부 다른 재질은 바이러스를 유지시켜 수율을 크게 감소시킬 수 있으므로, 반드시 계면활성제 제거 셀룰로오스 아세테이트(SFCA) 멤브레인을 사용해야 한다. SW32 로터가 장착된 원심 분리기를 사용하여 초원심 분리로 바이러스를 농축하며, 4 °C에서 20,000 rpm(~72,000 x g)으로 2.5시간 동안 회전시킨다. 초원심 분리로 바이러스를 농축하는 동안, 12-웰 플레이트의 CiA mESC를 5 µg/mL의 폴리브렌(polybrene)이 포함된 신선한 ES 배지로 처리한다. 바이러스 농축이 완료되면 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 바이러스 펠렛을 100 µL의 1x PBS에 현탁한다(기포가 과도하게 생기지 않도록 주의한다). 바이러스와 1x PBS를 1.5-mL 마이크로 튜브에 넣는다. 튜브를 300 x g(또는 최저 설정)에서 볼텍싱하거나 흔들어 바이러스를 완전히 현탁한다. 미니 테이블탑 원심 분리기로 튜브를 5~10초간 스핀 다운하여 기포를 제거한다. 12-웰 플레이트의 각 웰에 바이러스 30 µL를 첨가한다. 플레이트를 흔들어 섞은 다음, 1,000 x g에서 20분 동안 원심 분리한다. 참고: 첨가하는 바이러스의 양은 전달 컨스트럭트의 크기와 반비례하는 바이러스 타이터(viral titer)에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 액체 질소로 바이러스를 급속 냉동하여 -80 °C에 보관할 수 있다. 다만, 바이러스를 냉동하면 바이러스 타이터가 낮아진다. 12-웰 플레이트를 다시 37 °C 인큐베이터에 넣고, 다음 날 아침(~16시간 후)에 신선한 ES 배지로 교체한다. 감염 48시간 후, 적절한 항생제(예: 1.5 µg/mL 푸로마이신, 10 µg/mL 블라스티시딘 등)를 첨가하여 바이러스 플라스미드가 통합된 세포를 선택한다. 매일 배지를 교체하고, 대다수의 세포가 부유하거나 사멸한 경우 1x PBS로 세포를 세척한다. 선택 배지를 처리한 세포를 5% CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 72~96시간 동안 유지한다. Chiarella, A. M. 등. 화학적 후성유전학적 조절제를 통한 세포 내 기전 재지향을 이용한 유전자 전사 억제 J. Vis. Exp. (2018)
본 영상에서는 렌티바이러스 형질도입(lentiviral transduction)을 이용한 유전자 변형 마우스 배아줄기세포의 제작 방법을 보여줍니다. 렌티바이러스 입자는 항생제 내성 마커를 전달하여, 도입된 세포의 안정적인 게놈 통합 및 선택적 분리를 가능하게 합니다.
