재조합 바이러스 생성 그림 1에 따라, 무혈청 배지에서 감염 다중도(MOI) 1 초과로 BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (CV-1 세포에서 유래한 원숭이 신장 상피 세포주)] 세포 단일층을 백시니아 바이러스로 감염시킨다. 감염 1시간 후, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)으로 세포를 회복시키고, 무혈청 배지에서 재조합 벡터 플라스미드와 트랜스펙션 시약의 혼합물을 3:1 비율로 트랜스펙션한다. 24시간 후, 태아 송아지 혈청(FBS)이 포함되지 않은 DMEM에서 세포를 긁어내어 회수하고, 세 차례의 동결-해동 사이클을 수행하여 세포를 파쇄하고 바이러스 입자를 방출시킨다. 10% FBS DMEM과 GPT (E. coli 유래 Guanine Phosphoribosyltransferase 선택 시약, mycophenolic acid (25 µg/ml) 및 xanthine (250 µg/ml)) 액상 오버레이를 이용한 플라크 분석을 다음과 같이 수행한다. 6-웰 플레이트에 BS-C-1 세포 단일층을 배양한다. 개별 플라크가 충분히 분리되도록, 100% 합류된 세포 단일층에 바이러스 입자가 포함된 동결-해동 세포의 단계별 희석액을 감염시킨다. 최종 농도가 각각 25 µg/ml 및 250 µg/ml인 GPT 선택 시약(mycophenolic acid 및 xanthine)이 포함된 10% FBS DMEM 액상을 오버레이한다. 24시간 동안 배양한 후, 액상 오버레이를 제거하고 형광 현미경을 사용하여 TDS (transient dominant selection) 벡터의 mCherry가 바이러스에 삽입되어 나타나는 확산성 적색 형광 플라크를 찾는다. 표적 유전자와 선택한 형광 태그에 따라, 동일한 적색 플라크 내에서 태그된 유전자의 국소적 형광이 관찰될 수도 있다. 피펫 팁과 100 µl의 5% FBS 포함 DMEM을 사용하여 국소적으로 긁어내어 각 재조합 바이러스에 대해 여러 플라크를 채취해 Eppendorf 튜브로 옮긴 후, 긁어낸 세포를 세 차례 동결-해동하여 재조합 바이러스를 방출시킨다. 동결-해동된 바이러스가 포함된 DMEM을 12-웰 플레이트의 세포 단일층에 첨가하고, 성장 배지에 GPT 선택 시약을 넣어 재조합 바이러스를 증폭시킨다. 감염 24시간 후, 성공적으로 증폭된 세포를 긁어낸다. 적색 형광을 보이는 성공적으로 증폭된 플라크에 대해, 이번에는 아가로스 오버레이와 GPT 선택을 이용한 플라크 분석을 다음과 같이 수행한다. 6-웰 플레이트에 BS-C-1 세포 단일층을 배양한다. 재조합 바이러스를 단계별로 희석하고, FBS-free DMEM 내에서 바이러스 농도를 증가시키며 웰에 감염시킨다. 감염 1시간 후, 액체 배지를 제거하고 각 웰에 2.5% FBS, 292 µg/ml L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin 및 GPT 선택 시약이 포함된 최소 필수 배지(MEM) 내 0.5% 아가로스를 오버레이한다. 감염 2-3일 후, 적색과 선택한 형광 태그 색상을 모두 나타내는 플라크를 선택하여 이번에는 GPT 선택 없이 다시 증폭시킨다. 선택 시약 없이 아가로스 오버레이를 이용해 다음 플라크 분석을 수행한다. 확산성 적색 형광은 소실되었으나 선택한 태그에 해당하는 국소적 형광은 유지하고 있는 플라크를 채취한다. 선택 시약 없이 플라크 정제를 계속하여, mCherry 및 gpt 선택 유전자는 소실되었으나 선택한 태그에 해당하는 국소적 형광은 유지하고 있는 재조합 바이러스의 순수 스톡을 확보한다. 플라크 분석을 통해 스톡의 순도를 확인하며, 모든 플라크는 유사한 플라크 표현형을 보여야 한다. Marzook, N. B., 등, 형광 표지된 백시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을 위한 방법론 J. Vis. Exp. (2014)
이 영상에서는 감염된 상피 세포 내에서 플라스미드 매개 상동 재조합을 이용한 재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)의 생성을 보여줍니다. 형광 및 대사 마커를 통해 태그가 붙은 단백질을 발현하는 바이러스를 선택하고 식별할 수 있습니다.
