암세포 내 아데노바이러스 도입 및 siRNA 매개 넉다운의 병용 수행

초록

출처: Fuchs, M. 외. 아데노펙션(Adenofection): 결핍-구제 실험을 통한 세포 형태동역학 내 분자 샤페론의 역할 연구 방법. J. Vis. Exp. (2016) 이 비디오는 자궁경부암 세포에서 siRNA-인산칼슘 트랜스펙션을 결합한 아데노바이러스 매개 형광 트랜스진 전달 방법을 보여줍니다. 아데노바이러스는 형광 대체 단백질을 발현하며, siRNA는 RISC 결합을 통해 표적 mRNA 분해를 유도합니다. 이러한 순차적 공동 트랜스펙션은 내인성 단백질의 녹다운과 트랜스진에 의한 기능적 구제를 동시에 가능하게 하여, 형광 이미징을 통해 단백질 교체를 시각화하고 확인할 수 있게 합니다. Fuchs, M. 외. 아데노펙션: 결핍-복구 실험을 통해 세포 형태역학에서 분자 샤페론의 역할을 연구하는 방법. J. Vis. Exp. (2016)

이 영상에서는 자궁경부암 세포에서 siRNA-인산칼슘 형질전환과 결합된 아데노바이러스 매개 형광 트랜스진 전달 방법을 시연합니다. 아데노바이러스는 형광 표지된 대체 단백질을 발현하며, siRNA는 RISC 결합을 통해 표적 mRNA 분해를 유도합니다. 이러한 순차적 공동 형질전환을 통해 내인성 단백질의 녹다운과 트랜스진에 의한 기능적 회복을 동시에 구현함으로써, 형광 이미징을 통해 단백질 교체 여부를 시각화하고 확인할 수 있습니다.

프로토콜

1. 인산칼슘(CaPi) 침전물을 이용한 HeLa-RFP-H2B 세포 내 아데노바이러스 형질도입 및 소간섭 RNA(siRNA) 형질전환을 통한 내인성 단백질 넉다운

참고: 모든 Adenofection에서는 관심 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 최소량으로 사용하며, 무관한 유전자(i.e., LacZ)를 포함하거나 유전자가 없는 대조군 아데노바이러스를 사용하여 최소 감염 다중도(MOI, 10-20 plaque-forming units (PFU)/cell)를 맞춥니다.

참고: 이 절차는 대규모 세포 집단에서 세포당 발현 수준을 표준화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다.

1. 세포 플레이팅 하루 후, 추가로 플레이팅한 디쉬에서 세포 수를 측정한다. 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL 0.05% Trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)로 한 번 헹군다. 0.05% Trypsin/EDTA 1 mL를 다시 첨가하고 모든 세포가 탈착될 때까지 37 °C, 5% CO₂에서 배양한다. 1 mL 피펫을 사용하여 세포를 잘 분리하고, haemocytometer를 사용하여 mL당 세포 수를 측정한다.
2. 관심 단백질(POI)의 경우 세포당 2 PFU의 MOI로, 공벡터(예: LacZ)의 경우 세포당 18 PFU로 형질도입하여 총 세포당 20 PFU가 되도록 필요한 바이러스 양을 결정한다. 동시에, GFP-태그된 actin과 RFP-태그된 α-tubulin을 인코딩하는 각 바쿨로바이러스를 4 PFU씩 형질도입한다. 다음의 adenofection 프로토콜에 따라 세포에 형질도입한다.
3. 멸균 후드 내에서 조건별로 1.5 mL 플라스틱 튜브를 준비하고, 따뜻한 alpha minimum essential medium (αMEM) 400 μL를 넣는다.
4. 바이러스 분주액을 얼음 위에서 천천히 해동하며, 피펫팅 오차를 최소화하기 위해 1 μL 이상의 부피를 취할 수 있도록 필요한 경우 바이러스 스톡을 희석한다.
5. 400 μL αMEM이 들어있는 각 1.5 mL 플라스틱 튜브에 조건별로 계산된 바이러스 양을 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 섞는다. 바이러스의 활성을 유지하기 위해 바이러스 스톡을 즉시 -80 °C로 되돌린다.
6. 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고 바이러스 혼합액을 방울방울 조심스럽게 피펫팅하여 첨가한다. 세포가 바이러스로 충분히 덮이도록 37 °C, 5% CO₂에서 배양하며, 1시간 동안 15분마다 멸균 후드 내에서 플레이트를 조심스럽게 흔들어준다. 적은 양의 배지를 사용하면 바이러스와 세포의 접촉이 용이해진다.
7. 배양 후, 각 플레이트에 αMEM 1.6 mL를 조심스럽게 피펫팅하여 총 부피를 2 mL로 맞추고, 2 mM thymidine을 첨가하여 세포 동기화를 시작한 뒤 37 °C, 5% CO₂에서 2시간 더 배양한다.
8. 그동안 CaPi 형질전환 방법을 따라 siRNA 형질전환 혼합액을 준비한다(그림 1 참조). siRNA가 필요하지 않은 경우에는 멸균수로 siRNA 양을 대체하여 공(empty) 형질전환을 수행한다.
9. 조건당 200 μL의 혼합액을 계산하며, 이는 듀플리케이트(duplicate)당 400 μL가 된다. 다음은 최종 siRNA 농도가 50 nM인 경우의 예시이며, 각 관심 단백질에 맞게 조정해야 한다. 1.5 mL 플라스틱 튜브에 1 M CaCl₂ 50 μL와 20 μM siRNA 11 μL를 멸균 H₂O 139 μL에 넣고 볼텍싱하여 섞는다. 짧게 원심분리한 후, 2× HEPES-buffered saline (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.5 mM Na₂HPO₄, pH 7.01-7.05) 200 μL를 조심스럽게 방울방울 첨가한다.
   참고: 방울의 크기가 작을수록 침전물이 작게 형성되어 형질전환 효율이 높아진다. 200 μL 피펫을 사용하여 공기 주입 방식으로 세 번 부드럽게 섞는다.
10. 혼합액을 실온(RT)에서 30분 동안 배양한다. 형질전환 혼합액 200 μL를 각 플레이트에 천천히 첨가하고 십자 방향으로 흔들어준다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂로 옮겨 16시간 동안 배양한다.
11. 다음 날, 따뜻한 HEPES (6.7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) 2 mL로 세포를 두 번 헹구고 αMEM 2 mL를 첨가한다. 온도의 변화가 세포 주기의 길이에 영향을 미치므로 한 번에 4개 이상의 세포 플레이트로 진행하지 않는다.
12. 도립 형광 현미경을 사용하여 20-40배(공기 렌즈) 배율에서 감염 효율을 시각화하고, 기록을 위해 조건별로 형광 채널과 투과 채널 모두에서 대표 이미지 3장을 획득한다. 7시간 후, 2 mM thymidine을 첨가하고 37 °C, 5% CO₂에서 16시간 더 배양한다.
13. siRNA 형질전환 및 바이러스 감염 48시간 후인 다음 날, 따뜻한 phosphate-buffered saline (PBS) 2 mL로 세포를 두 번 헹구고, 생세포 이미징을 위해서는 Phenol Red가 없는 αMEM 2 mL에서, 단백질 추출을 위해서는 Phenol Red가 포함된 αMEM 2 mL에서 7시간 동안 방치한다.
14. 형질전환 48시간 후, 각 조건의 세포를 수확하여 단백질 추출물을 준비하고 Western blot 분석을 통해 넉다운(knockdown) 효율과 내인성 단백질의 발현을 확인한다.
    참고: 관심 단백질에 대한 항체와 로딩 컨트롤로 사용할 적절한 항체를 사용한다. 넉다운 효율은 컨트롤 세포 용해물(컨트롤 siRNA로 형질전환됨)을 점진적으로 감소시켜 로딩함으로써 적정 곡선(즉, 1, ½, ¼, ⅛)을 통해 결정해야 한다.

결과

그림 1. 전형적인 아데노펙션 프로토콜 계획. CaPi 침전물을 사용하는 프로토콜(회색 밑줄) 또는 양이온성 지질 트랜스펙션 시약을 사용하는 프로토콜(노란색 강조)의 전형적인 실험 단계들이 세포 플레이팅, 아데노바이러스 및 바쿨로바이러스의 트랜스덕션, siRNA 듀플렉스의 트랜스펙션, 그리고 이중 티미딘 블록을 이용한 세포 동기화를 포함하여 나타나 있다. 두 프로토콜의 시간 경과는 그림의 오른쪽에 시간 단위(hours)로 표시되어 있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
EDTA	Sigma	E5134
소태아혈청 (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
피브로넥틴	Sigma	F1141
글래스 바텀 디쉬, 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C 케이스
HeLa-RFP-H2B	캐나다 퀘벡의 Sabine Elowe 박사의 제공으로 수령함
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-글루타민	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
최소 필수 배지(MEM) 알파	Wisent	310-101-CL
데소キシ리보뉴클레오사이드/리보뉴클레오사이드가 포함되지 않은 최소 필수 배지(MEM) Alpha	Thermo Fisher	12000-022
페놀 레드(Phenol Red)가 포함되지 않은 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM) Alpha	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
아데노바이러스 맞춤형 설계	Welgen	맞춤형 설계
염화칼슘	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
siRNA 이중 가닥	Dharmacon	사용자 정의 설계
티미딘	Sigma	T9250
2.5% 트립신	Thermo Fisher	15090-046