설계된 바이러스 유사 입자의 표면 노출 시스테인 잔기 표지

초록

1. Nicotiana benthamiana 식물로부터의 바이러스 접종 및 VLP 정제 Ambion의 T7-mMessage mMachine Kit를 사용하여 Maize rayado fino virus (MRFV) 야생형(wt) 및 시스테인 돌연변이 외피 단백질(CP) 유전자를 포함하는 Potato virus X (PVX) 기반 벡터 플라스미드로부터 캡핑된 T7-RNA 전사체를 생성한다. 각 T7 전사 반응마다 N. benthamiana의 완전히 확장된 잎 두 장에 10 μL의 반응액을 접종하고, 온실 내에서 습도 60%, 25 °C에서 16시간 광조사(25,000-30,000 lux), 20 °C에서 8시간 암조건으로 10일 동안 배양한다. 접종 후 10일(dpi)에 바이러스에 감염된 N. benthamiana 잎을 수확하고, 식물 조직(50g)의 무게를 잰 후 얼음 위에 둔다. 냉각된 0.5 M Na-Citrate 완충액(pH 5.5, 식물 조직 1g당 완충액 2mL 사용) 100 mL를 넣고 블렌더에서 식물 재료를 균질화한다. 균질물을 거즈 3겹으로 걸러내고 27,000 × g에서 30분 동안 원심분리하여 투명하게 만든다. 상층액을 냉각된 메스실린더로 옮겨 부피를 측정한 후, 냉각된 멸균 비커로 옮긴다. 펠릿은 버린다. 상층액에 10% 폴리에틸렌 글리콜 8,000(PEG 8,000)을 첨가하여 4 °C에서 15분 동안 교반하고, 바이러스 유사 입자(VLP)-PEG 매트릭스를 침전시키기 위해 4 °C에서 45분 동안 추가로 배양한다. 시료를 4 °C에서 27,000 × g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다. 2% Triton X-100이 포함된 0.05 M Na-Citrate 완충액(pH 5.5) 8 mL를 첨가하여 펠릿을 처리한다. 원심분리 튜브를 잘 흔들어 펠릿을 분리한다. 펠릿과 완충액을 냉각된 멸균 비커로 옮긴다. 즉시 동일한 완충액 2 mL로 튜브를 헹궈 비커에 넣는다. 펠릿이 녹을 때까지(일반적으로 1시간) 4 °C에서 현탁액을 교반한다. 27,000 × g에서 5분 동안 원심분리하여 투명하게 만든 후 펠릿을 버리고, 상층액을 4 °C에서 140,000 × g로 2시간 동안 원심분리한다. 펠릿을 1 mL의 0.05 M Na-Citrate 완충액(pH 5.5)에 재현탁하고, 이 현탁액을 0.05 M Na-Citrate 완충액(pH 5.5)으로 제조한 10-40% 수크로스 밀도 구배 상단에 얹는다. 구배를 4 °C에서 140,000 × g로 3시간 동안 원심분리한다. 원심분리 튜브 상단에 빛을 비추어 튜브 상단에서 4 cm 지점에 나타나는 빛 산란 상단 밴드를 수집하고, 0.05 M Na-Citrate 완충액(pH 5.5)으로 희석한 후 4 °C에서 140,000 × g로 3시간 동안 원심분리한다. 펠릿을 0.5 mL의 멸균수에 재현탁하여 4 °C에서 최대 6개월 동안 보관한다. Bradford 단백질 분석법을 통해 VLP 농도를 정량한다. VLP 수율은 식물 조직 1g당 1~3 μg 사이이다. 2. VLP의 플루오레세인-5-말레이미드 표지 반응 50 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.0, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))에 1 mM 플루오레세인-5-말레이미드(427.37 g/mole) 용액을 준비한다. 볼텍스로 섞어 완전히 용해되었는지 확인한다. 알루미늄 호일을 사용하여 튜브를 빛으로부터 보호한다. 1단계에서 생성된 VLP에 플루오레세인-5-말레이미드를 첨가하고 섞는다. 설프히드릴기의 몰수 대비 플루오레세인-5-말레이미드를 25배 몰 과량으로 사용한다. 일반적으로 1 μg/μL 농도의 VLP 30 μL와 플루오레세인-5-말레이미드 용액 60 μL를 사용하면 적절한 결과를 얻을 수 있다. 상온에서 2시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시킨다. 최종 농도가 50 mM이 되도록 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 반응을 종료한다. 탈염 스핀 컬럼(Thermo Scientific Inc., Rockford IL)을 사용하고 상온에서 1,500 × g로 2분 동안 원심분리하여 반응하지 않은 플루오레세인을 제거한다. SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 분석을 위해, 각 반응액 10 μL에 2 × SDS-PAGE Laemmli 시료 완충액 10 μL를 첨가한다. 표지된 단백질은 빛으로부터 보호하여 4 °C에서 최대 1개월 동안 보관하거나, 1회 사용분으로 분주하여 -20 °C에서 최대 3개월 동안 보관한다. Natilla, A., 및 Hammond, R. W. Nicotiana benthamiana 식물에서 생산된 Maize rayado fino virus 바이러스 유사 입자의 시스테인 잔기 용매 접근성 분석 및 VLPs에 대한 펩타이드 가교 결합. J. Vis. Exp. (2013)

본 영상에서는 티올 반응성 염료를 사용하여 Nicotiana benthamiana에서 생성된 돌연변이 바이러스 유사 입자(VLP)의 부위 특이적 형광 표지 방법과, 표면 수정을 확인하기 위한 정제 및 겔 전기영동 과정을 보여줍니다.

프로토콜

1. Nicotiana benthamiana 식물을 이용한 바이러스 접종 및 VLP 정제

1. Ambion의 T7-mMessage mMachine Kit를 사용하여 Maize rayado fino virus (MRFV) 야생형 (wt) 및 Cysteine 변이 외피 단백질 (CP) 유전자를 포함하는 Potato virus X (PVX) 기반 벡터 플라스미드로부터 캡핑된 T7-RNA 전사체를 생성한다.
2. 각 T7 전사 반응당 10 μL의 반응물을 N. benthamiana의 완전히 확장된 잎 2장에 접종하고, 습도 60%의 온실에서 25 °C에서 16시간 광조사 (25,000-30,000 lux) 및 20 °C에서 8시간 암조건으로 10일 동안 배양한다.
3. 접종 후 10일 (dpi)에 바이러스에 감염된 N. benthamiana 잎을 수확하고, 식물 조직 (50 grams)의 무게를 잰 후 얼음에 둔다.
4. 냉각된 0.5 M Na-Citrate 버퍼 (pH 5.5) 용액 100 mL (식물 조직 1g당 버퍼 2 mL 사용)를 넣고 블렌더에서 식물 재료를 균질화한다.
5. 균질액을 치즈클로스 3겹으로 여과하고 27,000 × g에서 30분 동안 원심분리하여 청징화한다. 상층액을 냉각된 메스실린더로 옮겨 부피를 측정한 후, 냉각된 멸균 비커로 옮긴다. 펠릿은 폐기한다.
6. 상층액에 10% polyethylene glycol 8,000 (PEG 8,000)을 첨가하고 4 °C에서 15분 동안 교반한 뒤, 4 °C에서 45분 더 배양하여 바이러스 유사 입자 (VLPs)-PEG 매트릭스를 침전시킨다.
7. 시료를 4 °C에서 27,000 × g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
8. 2% Triton X-100을 포함하는 0.05 M Na-Citrate 버퍼 (pH 5.5) 8 mL를 첨가하여 펠릿을 처리한다. 원심분리 튜브를 잘 흔들어 펠릿을 분리한다. 펠릿과 버퍼를 냉각된 멸균 비커로 옮긴다. 즉시 동일한 버퍼 2 mL로 튜브를 헹구어 비커에 추가한다. 펠릿이 용해될 때까지 (일반적으로 1시간) 4 °C에서 현탁액을 교반한다.
9. 27,000 × g에서 5분 동안 원심분리하여 청징화하고 펠릿을 폐기한 후, 상층액을 4 °C에서 140,000 × g로 2시간 동안 원심분리 처리한다.
10. 펠릿을 1 mL 0.05 M Na-Citrate 버퍼 (pH 5.5)에 재현탁하고, 이 현탁액을 0.05 M Na-Citrate 버퍼 (pH 5.5)로 제조한 10-40% sucrose 구배 상단에 얹는다.
11. 구배를 4 °C에서 140,000 × g로 3시간 동안 원심분리한다.
12. 원심분리 튜브 상단에 빛을 비추어 튜브 상단에서 4 cm 지점의 빛 산란 상단 밴드를 수집하고, 0.05 M Na-Citrate 버퍼 (pH 5.5)로 희석한 후 4 °C에서 140,000 × g로 3시간 동안 원심분리한다.
13. 펠릿을 0.5 mL의 멸균수에 재현탁하여 4 °C에서 최대 6개월 동안 보관한다.
14. Bradford 단백질 정량법을 수행하여 VLPs 농도를 정량한다. VLPs의 수율은 식물 조직 1g당 1-3 μg 사이이다.

2. VLP의 Fluorescein-5-maleimide 표지 반응

1. 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)에 fluorescein-5-maleimide (427.37 g/mole) 1 mM 용액을 준비한다. Vortex를 사용하여 혼합하고 완전히 용해되었는지 확인한다. 알루미늄 호일을 사용하여 튜브를 빛으로부터 차단한다.
2. 1단계에서 생성된 VLP에 fluorescein-5-maleimide를 첨가하고 혼합한다. 설프히드릴(sulfhydryl)의 몰 양 대비 fluorescein-5-maleimide를 25배 몰 과량으로 사용한다. 일반적으로 1 μg/μL 농도의 VLP 30 μL와 fluorescein-5-maleimide 용액 60 μL를 사용하면 적절한 결과가 얻어진다.
3. 반응물을 실온에서 2시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다.
4. dithiothreitol (DTT)을 최종 농도 50 mM이 되도록 첨가하여 반응을 종결시킨다.
5. desalting spin column (Thermo Scientific Inc., Rockford IL)을 사용하고 실온에서 1,500 × g로 2분 동안 원심 분리하여 반응하지 않은 fluorescein을 제거한다.
6. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 분석을 위해, 각 반응물 10 μL에 2 × SDS-PAGE Laemmli sample buffer 10 μL를 첨가한다. 표지된 단백질은 빛을 차단하여 4 °C에서 최대 한 달 동안 또는 -20 °C에서 1회 사용분으로 분주하여 최대 3개월 동안 보관한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박벽 투명 튜브	Beckman	344059
mMessage mMachine T7 Kit	Life Technologies	AM1344M
플루오레세인-5-말레이미드	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130는 고장 났으므로 F150으로 대체하십시오.
Laemmli 완충액	Bio-Rad	1610737
Tris-Glycine SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 전개 버퍼	Invitrogen	LC2675
Tris-Glycine 전이 버퍼	Invitrogen	LC3675
니트로셀룰로오스 막 필터 페이퍼 샌드위치	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimide-Polyethylene glycol (PEG) 2-Biotin, No-Weigh Format	Thermo Scientific	21901