엔지니어링된 E. coli에서의 바이러스 유사 입자 생산

초록

출처: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)

본 영상에서는 엔지니어링된 E. coli에서 박테리오파지 Qβ 외피 단백질을 조절 발현시키는 방법을 보여줍니다. 이렇게 생성된 단백질은 바이러스 유사 입자로 자가 조립되며, 이는 후속 생체 접합 공정을 위해 수확됩니다.

프로토콜

Qβ 발현

1. 1:1 표백제/에탄올 혼합액으로 벤치 구역을 닦습니다.
2. 무균 환경에서 3 mL의 Super Optimal Broth (SOB) 배지에 E. coli BL21(DE3) 단일 콜로니를 접종하여 3 mL 스타터 배양액 2개를 준비합니다.
3. 37 °C, 상대 습도(rH) 0% 조건의 배양실 내 진탕배양기에서 250 rpm으로 하룻밤 동안 배양합니다.
4. SOB 배지에 스타터 배양액을 접종합니다:
   1. 진탕배양기에서 3 mL 스타터 배양액 2개를 꺼내어, 무균 환경에서 각각의 배양액을 1 L의 신선한 SOB 배지가 들어 있는 2 L 배플 삼각플라스크 2개에 나누어 붓습니다.
   2. 접종된 배지를 37 °C, 0% rH 조건의 배양실 내 진탕배양기에서 250 rpm으로 배양합니다.
5. OD₆₀₀ 수치가 0.9–1.0에 도달할 때까지 37 °C, 0% rH 조건의 배양실 내 진탕배양기에서 250 rpm으로 박테리아를 배양합니다.
6. P1000 피펫을 사용하여 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mL를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다.
7. 배지를 37 °C, 0% rH 조건의 배양실 내 진탕배양기에서 250 rpm으로 하룻밤 동안 둡니다.
8. 다음 날 아침 진탕배양기에서 배지를 꺼내어 1000 mL 원심분리용 병을 사용하여 4 °C에서 20,621 × g로 1시간 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다.
9. 상층액은 버리고 세포 펠릿을 수집합니다.
   1. 박테리아를 사멸시키기 위해 상층액을 약 5 mL의 표백제가 들어 있는 플라스크에 붓습니다. 이는 폐기물로 처리합니다.
   2. 스패튤라를 사용하여 원심분리용 병 바닥에서 세포 펠릿을 긁어모아 50 mL 원심분리 튜브에 넣습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, 분말	Research Products International	T60060-1000.0
Yeast Extract, 분말	Research Products International	Y20020-1000.0
무수 황산 마그네슘	P212121	CI-06808-1KG
염화 나트륨 (결정형/ACS 인증)	Fisher Scientific	S271-10
염화 칼륨	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 초순수 제조 장치	Fisher Scientific	4474524
인산 일수소 칼륨	Fisher Scientific	BP362-1
무수 인산 이수소 칼륨	Fisher Scientific	P288-500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
캡 포함 Nalgene 원심분리 병, 폴리프로필렌 공중합체	Thermo Scientific	3141-0250
VWR Os-500 오비탈 쉐이커	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
Falcon 50 mL 원추형 원심분리 튜브	Fisher Scientific	14-432-22