이황화 결합 재가교를 통한 바이러스 유사 입자의 형광 기능화

이 논문에서

초록

이 영상에서는 환원된 이황화 결합을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커로 재가교하여 바이러스 유사 입자를 형광 기능화하는 방법을 보여주며, 이를 통해 생의학 응용 분야의 세포 이미징 및 표적 전달에 적합한 안정적이고 추적 가능한 컨쥬게이트를 생성합니다.

프로토콜

1. 박테리오파지 Qβ에 Dibromomaleimide (DB) 화합물 접합시키기

Qβ의 이황화 결합 환원.
1. 0.0020 g의 tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)을 1 mL의 초순수에 녹여 100x 스톡 용액을 제조한다.
  참고: 환원 전 TCEP를 새로 준비한다.
2. 마이크로원심분리 튜브에 Qβ (5 mg/mL) 200 µL를 넣는다.
3. 이어서 100x TCEP 스톡 용액 20 µL를 첨가한다.
4. 실온에서 1시간 동안 배양한다.
dibromomaleimide polyethylene glycol (DB-PEG)를 사용하여 환원된 이황화 결합의 재가교.
1. 0.0017 g의 dibromomaleimide-polyethylene glycol (DB-PEG)를 100 µL의 DMF에 녹인다.
2. 10 mM sodium phosphate 용액 (pH 5) 680 µL를 첨가한다.
3. DB-PEG 용액에 환원된 Qβ를 첨가하고 365 nm UV (자외선) 램프 하에서 혼합 과정을 관찰한다. 혼합 즉시 365 nm 휴대용 UV 램프로 밝은 노란색 형광을 확인할 수 있다.
4. 로티세리 위에서 실온(RT)으로 하룻밤 동안 반응시킨다.
1x PBS (phosphate-buffered saline)를 사용하여 4 °C, 3,283 x g에서 20분 동안 원심분리 필터 (molecular weight cut-off (MWCO) = 10 kDa)로 반응 혼합물을 3회 정제한다.
non-reducing SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 및 native agarose 겔 전기영동으로 접합 여부를 확인한다.
참고: VLP (virus-like particles)는 native agarose 겔에서 온전한 입자 상태로 이동하며, 전하, 크기 및 모양에 따라 분리된다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호
2,3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polyethylene glycol	Alfa Aesar	41561-22
Sodium phosphate	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammonium persulfate	Fisher Scientific	BP179-100
Amicon Ultra-4 원심분리 필터 유닛	Millipore Sigma	UFC801024
Falcon 15 mL 원추형 원심분리 튜브	Fisher Scientific	14-959-53A
마이크로 원심분리 튜브: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 궤도 쉐이커	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 실험실용 클래식 고정밀 전자저울	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100

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