투과전자현미경 분석을 위한 안전한 바이러스 시료 준비

초록

출처: Blancett, C. D., 등생물안전구역 내 바이러스 시료의 음성 염색을 위한 캡슐 활용. J. Vis. Exp. (2017).

이 영상은 투과 전자 현미경 분석을 위한 안전한 바이러스 시료 준비 과정을 보여줍니다. 바이러스 입자는 glutaraldehyde로 고정되고 전자 밀도가 높은 염색제로 염색되며, 구조를 안정화하고 완전한 불활성화를 보장하기 위해 osmium tetroxide 증기 고정 과정을 거칩니다. 이를 통해 바이러스 샘플을 안전하게 취급하는 동시에 고품질 TEM 이미징을 위한 대비를 향상시킬 수 있습니다.

프로토콜

1. 수성 글루타르알데히드 및 1% 사산화오스뮴 증기 불활성화를 이용한 생물안전격리 구역 내 음성 염색을 위한 캡슐법

1. 생물안전 작업대(BSC) 내부에서, 피펫에 장착된 캡슐로 바이러스 현탁액 40 µL를 흡입합니다.
   참고: 프로세스가 완료될 때까지 피펫은 캡슐에 장착된 상태를 유지합니다.
2. 그리드가 수평이 되도록 피펫을 옆으로 눕혀 10분 동안 둡니다. 이는 코팅된 그리드 위에 바이러스 입자가 고르게 분포되도록 하기 위함입니다.
3. 생물안전 BSC 내부의 캡슐 안에서 바이러스를 불활성화합니다.
   1. 피펫을 들어 올려 플런저를 눌러 바이러스 용액을 폐기물 용기에 배출합니다.
   2. 캡슐로 2% glutaraldehyde 고정액 40 µL를 흡입합니다. 주의: Glutaraldehyde는 유해 화학물질이므로 적절한 보호 장구가 필요합니다. Glutaraldehyde는 일반 BSC에서 짧은 시간 동안 사용할 수 있으나, 시약을 장시간 개방하여 사용하는 경우에는 덕트형 BSC 또는 화학 흄 후드에서 작업해야 합니다.
   3. 피펫을 옆으로 눕혀 20분 동안 둡니다. 이는 샘플이 충분히 고정되도록 하기 위함입니다.
   4. 고정액을 배출하고 캡슐로 DI(탈이온)수 40 µL를 흡입하여 고정액을 씻어냅니다. 이 세척 단계를 총 3회 반복합니다.
4. 캡슐로 1% uranyl acetate (UA) 또는 1% potassium phosphotungstic acid (PTA) 중 하나를 40 µL 흡입하고 30초 동안 둡니다.
   참고: 염색 시간은 바이러스 샘플에 따라 10초에서 1분까지 달라질 수 있습니다.
   주의:: UA는 알파 입자 방출체이자 누적 독성 물질입니다. 적절한 보호 장구를 갖추고 취급하십시오.
5. 피펫에서 캡슐을 분리하고, 그리드가 캡슐 안에 있는 상태에서 여과지 조각을 그리드 가장자리에 접촉시켜 그리드의 물기를 제거합니다.
6. 사산화오스뮴(Osmium Tetroxide) 증기 불활성화 절차입니다.
   1. 뚜껑을 연 상태의 캡슐을 1% 사산화오스뮴 용액에 적신 여과지가 들어 있는 50 mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 주의: 사산화오스뮴은 증기압이 낮으며 독성이 매우 강합니다. 반드시 덕트형 BSC 또는 화학 흄 후드에서 사용해야 합니다. 적절한 보호 장구를 갖추고 취급하십시오. 작업 구역에 경고 정보를 게시하십시오.
   2. 사산화오스뮴 증기가 완전히 침투할 수 있도록 50 mL 원심분리 튜브를 1시간 동안 밀봉합니다. 그 후 튜브를 오염 제거하고 생물안전 구역 밖의 BSL-2 EM(전자현미경) 시설로 옮깁니다.
7. 캡슐에서 EM 그리드를 꺼냅니다.
   1. BSL-2 EM 시설에서 원심분리 튜브로부터 캡슐을 분리하여 피펫에 장착합니다.
   2. 캡슐로 DI수 40 µL를 흡입하고 폐기물 용기에 3회 배출합니다.
   3. 피펫에서 캡슐을 분리하고 여과지를 그리드 가장자리에 접촉시켜 그리드의 물기를 제거합니다.
   4. 공기 건조 후, 향후 TEM(투과전자현미경) 이미징을 위해 그리드를 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Formvar/탄소 코팅 TEM 그리드	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g 캡슐	EMS	85010-01	box
mPrep/f 커플러	EMS	85010-11	standard 16/Pk
글루타르알데하이드	EMS	16320	50% solution, EM grade
오스뮴 테트라옥사이드	EMS	19190	4% aqueous solution
우라닐 아세테이트	EMS	22400	powder
인몰브덴산 칼륨	EMS	19500	powder
여과지	Whatman	1450-090	size 50
투과 전자 현미경	JEOL	JEM-1011	TEM