바이러스 뉴클레오캡시드 유사 입자의 인비트로(In Vitro) 재구성 및 정제

초록

출처: Gao, Y., et al. 호흡기 세포융합 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 생성 및 조립. J. Vis. Exp. (2021)

본 영상에서는 정제된 RNA-free 뉴클레오단백질-인단백질 복합체로부터 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드를 시험관 내(in vitro)에서 조립하는 방법과 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 정제 과정, 그리고 조립된 입자 내의 전체 길이 바이러스 RNA 검증 과정을 보여줍니다.

프로토콜

1. 분자 클로닝

참고: 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 이시스트론성 공동발현 벡터 플라스미드를 제작하기 위해 리가아제 독립적 클로닝(LIC) 기법을 사용하였다. LIC는 1990년대 초에 개발된 방법으로, T4 DNA 폴리머라제(polymerase)의 3’-5’ Exo 활성을 이용하여 벡터와 DNA 삽입물 사이에 상보적인 오버행(overhang)을 생성한다. 제작된 구축물은 개방형 읽기 틀(ORF)의 N-말단에 10x His 태그가 포함된 2BT-10 벡터 DNA를 사용하여 제작되었다(그림 1).

1. SSPI 소화를 이용하여 LIC 벡터의 선형화를 수행한다.
   1. 10 μL의 SSPI 10X 버퍼, 5 U/μL 농도의 SSPI 효소 4 μL, 5 μg의 벡터 miniprep DNA에 해당하는 부피, 그리고 멸균된 ddH₂O를 합쳐 100 μL로 맞춘다.
   2. 소화 반응물을 37 °C에서 3시간 동안 배양한다.
   3. 벡터 DNA 추출을 위해 소화된 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동한다.
   4. 겔 추출 키트를 사용하여 추출 및 정제를 수행한다. 최종 부피의 벡터 DNA를 30 μL의 ddH₂O에 현탁하여 -20 °C에 보관한다.

2. N1-391 Forward 프라이머, N1-391 Reverse 프라이머, P1-126 Forward 프라이머 및 P1-126 Reverse 프라이머(표 1)를 사용하여 N1-391 및 P1-126 DNA 삽입물을 준비한다.

   참고: 선형화된 벡터와 충분한 중첩 부위가 있어 55 °C에서 60 °C 사이의 해리 온도(melting temperature)를 보장한다. Reverse 프라이머의 경우, 동일한 이유로 선형화된 벡터의 역상보 가닥과 충분한 중첩 부위가 있다.

   표 1. 프라이머 서열.

   프라이머	서열
   N1-391 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’
   N1-391 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3'
   P1-126 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3'
   P1-126 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’

   1. 표 2 및 표 3의 조건을 사용하여 DNA 삽입물의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행한다.
   2. 증폭된 DNA 삽입물을 추출한다. 이전 단계의 PCR 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 겔 추출을 통해 밴드를 추출 및 정제한다. 추출된 DNA의 최종 부피를 15 μL의 ddH₂O에 현탁한다.

   표 2. DNA 삽입물 PCR 증폭 시약.

   DNA 삽입물 PCR 증폭
   15 μL	10x Pfu polymerase 반응 버퍼
   3 μL	Forward 프라이머 (100 μM 농도)
   3 μL	Reverse 프라이머 (100 μM 농도)
   15 μL	2.5 mM 농도의 Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP) 믹스
   6 μL	N 또는 P 유전자를 포함하는 Plasmid DNA (100ng/ μL)
   7 μL	Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
   3 μL	2.5U/μL Pfu polymerase
   150 μL까지 채우는 부피	멸균된 ddH2O

   표 3. DNA 삽입물 PCR 증폭 열순환 프로그램.

   DNA 삽입물 PCR 증폭
   단계	시간	온도	사이클
   변성(Denaturation)	4 min.	95 ºC	1
   변성(Denaturation)	45 sec.	95 ºC	30
   결합(Annealing)	30 sec.	62 ºC
   신장(Extension)*	90 sec.	72 ºC
   신장(Extension)	10 min.	72 ºC	1
   유지(Hold)	∞	4 ºC	1
   150 μL 혼합물은 세 개의 개별 PCR 반응(3 x 50μL)으로 나누어 수행할 수 있다.
   *Pfu DNA polymerase의 경우, 신장 단계의 권장 속도는 1 kb/min이다. 여기서 N1-391 유전자 또는 P1-126 유전자의 길이는 모두 1.5 Kb보다 짧다. 따라서 신장 단계에 90초를 사용하였다.

3. 벡터 및 삽입 DNA의 T4 DNA polymerase 처리(표 4).

   표 4. T4 DNA polymerase 처리.

   T4 DNA polymerase 처리
   10 x 버퍼	2 μL
   벡터/삽입 DNA (0.1 pmol 벡터 또는 0.2 pmol 삽입물)	5 μL
   25 mM dNTP*	2 μL
   100 mM DTT	1 μL
   T4 DNA polymerase (LIC 적합)	0.4 μL (1.25 U)
   멸균된 ddH2O	9.6 μL
   *벡터에는 dGTP를 사용하였고, 삽입 DNA에는 dCTP를 사용하였다.

   참고: 처리는 벡터 DNA와 삽입 DNA에 대해 각각 별도로 수행해야 한다.

   1. 혼합물을 실온에서 40분 동안 배양한다. 그 후, 75 °C에서 20분 동안 중합효소를 열불활성화시킨다. 반응 혼합물을 -20 °C에 보관한다.
4. LIC 벡터와 삽입 벡터를 어닐링(Anneal)한다.
   1. 2 μL의 LIC 벡터 DNA와 2 μL의 멸균된 ddH₂O를 사용하여 음성 대조군을 설정한다.
   2. 앞선 T4 DNA polymerase 반응에서 얻은 2 μL의 삽입 DNA와 2 μL의 LIC 벡터 DNA를 0.2 mL 튜브에 혼합한다.
   3. 어닐링 반응을 실온에서 10분 동안 수행한다.
   4. 25 mM 농도의 Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) 1.3 μL로 반응을 중단시킨다.
   5. 반응물을 100 μL의 Escherichia coli Top10 컴피턴트 세포(competent cells)에 형질전환하고 ampicillin 선택 배지에 도말한다.
5. 양성 구조체를 식별한다.
   1. 플라스미드 miniprep 용액을 준비한다. 이는 콜로니 피킹 후 Luria Broth (LB) 배지에 접종하여 수행할 수 있다. 일반적으로 3개의 콜로니면 충분하다.
   2. 혼합물을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한다.
   3. 혼합물을 4,560 x g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
   4. 펠렛을 250 μL의 P1 버퍼에 재현탁하고, 스핀 miniprep 키트를 사용하여 플라스미드 miniprep을 준비한다.
   5. AseI 또는 다른 제한효소를 사용하여 miniprep 생성물의 소화 분석을 실시한다.
   6. 샘플을 0.8% 아가로스 겔에 로딩하고 소화된 플라스미드를 전기영동한다. UV 램프 아래에서 겔을 분석한다.
   7. 시퀀싱 서비스를 이용하여 양성 생성물의 서열을 검증한다.

6. 공발현(coexpression) DNA 삽입물을 획득한다.

   1. 이전에 구축한 2BT-10 N1-391 및 2BT-10 P1-126을 템플릿으로 사용하여 PCR을 수행함으로써 N1-391 및 P1-126을 획득한다.
   2. N1-391 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́를 사용하여 표 2 및 표 3의 PCR 조건으로 2BT-10 N1-391 구조체로부터 N1-391을 얻기 위한 1차 PCR을 수행한다.
   3. Forward 프라이머 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́와 P1-126 Reverse 프라이머를 사용하여 (표 2 및 표 3의 PCR 조건을 사용) 2BT-10 P1-126 구조체로부터 P1-126을 얻기 위한 2차 PCR을 수행한다.
   4. 마지막으로, N1-391과 P1-126을 병합하기 위해 앞선 두 번의 PCR 반응 생성물을 혼합하여 오버랩(overlap) PCR을 수행한다. N1-391 Forward 프라이머와 P1-126 Reverse 프라이머를 사용하며, 표 5 및 표 6의 PCR 조건을 사용한다.

   표 5. 오버랩 PCR 시약.

   오버랩 PCR
   15 μL	10 X Pfu polymerase 반응 버퍼
   3 μL	Forward 프라이머 (100 μM)
   3 μL	Reverse 프라이머 (100 μM)
   15 μL	dNTP 믹스 (2.5 mM)
   3 μL	N1-391 유전자를 포함하는 1차 PCR DNA (100 ng/μL )
   3 μL	P1-126 유전자를 포함하는 1차 PCR DNA (100 ng/μL )
   7 μL	DMSO
   3 μL	Pfu polymerase (2.5 U/μL)
   150 μL까지 채우는 부피	멸균된 ddH2O

   표 6. 오버랩 PCR 열순환 프로그램.

   오버랩 PCR
   단계	시간	온도	사이클
   변성(Denaturation)	4 min.	95 °C	1
   변성(Denaturation)	45 sec.	95 °C	30
   결합(Annealing)	30 sec.	62 °C
   신장(Extension)*	2 min.	72 °C
   신장(Extension)	10 min.	72 °C	1
   유지(Hold)	∞	4 °C	1
   150 μL 혼합물은 세 개의 개별 PCR 반응(3 x 50 μL)으로 나누어 수행할 수 있다.
   *Pfu DNA polymerase의 경우, 신장 단계의 권장 속도는 1 kb/min이다. 여기서 N1-391 및 P1-126 유전자의 총 길이는 2.0 Kb보다 짧다. 따라서 신장 단계에 2분을 사용하였다.

7. 벡터와 DNA 삽입물을 결합한다.
   1. 단계 1.3의 프로토콜에 따라 오버랩 PCR 생성물을 T4 DNA polymerase로 처리한다.
   2. 단계 1.4의 프로토콜에 따라 LIC 벡터와 PCR 생성물을 어닐링한다.
   3. 단계 1.5의 프로토콜에 따라 양성 구조체를 식별한다.

2. 단백질 발현 및 정제

참고: N과 P의 공동 발현을 위한 이시스트론성(bi-cistronic) 컨스트럭트에는 E. coli를 사용하십시오. 세포는 37 °C에서 배양하되, 발현은 저온(16 °C)에서 하룻밤 동안 수행하십시오. 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 조합하여 단백질 복합체를 정제하십시오(그림 2).

1. 단백질 생산을 위해 E. coli BL21(DE3) 균주를 사용한다. LB (Luria Broth) 배지에서 37 °C로 4 L 세포 배양액을 OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때까지 배양한다.
2. 온도를 16 °C로 낮춘다. 한 시간 후, 0.5 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 하룻밤 동안 발현을 유도한다.
3. 세포를 4,104 x g에서 25분 동안 원심분리한 후 상층액을 버린다.
4. 세포 펠렛을 200 mL의 용해 버퍼 A (50 mM sodium phosphate, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 10% glycerol, 0.2% NP40)에 재현탁한다. 세포 배양액 1 L당 50 mL의 용해 버퍼를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁한다.

5. 초음파 파쇄기를 사용하여 15분 동안 (3초 작동, 3초 정지) 세포를 용해한다. 그 후 세포를 37,888 x g에서 40분 동안 원심분리한다.

   참고: 초음파 파쇄 전 세포를 -80 °C 냉동고에 얼려 프로토콜을 일시 중단할 수 있다.

6. 용해 버퍼 5-10 컬럼 부피(CV)로 사전 평형화된 약 10mL의 비드가 충전된 코발트 중력 컬럼(직경 x 길이: 2.5 cm x 10 cm)에 상층액을 로딩한다.
7. 버퍼 B (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% glycerol, 5 mM imidazole) 5 CV와 버퍼 C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM imidazole) 5 CV로 컬럼을 세척한다.
8. 버퍼 D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole) 2 CV를 사용하여 비드에서 단백질을 용출한다.
9. 용출된 단백질을 Q 컬럼용 QA 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glycerol)로 5배 희석한다.
10. 5 mL Q 컬럼을 QA 버퍼로 세척하여 평형화한 후, 연동 펌프(예: Rabbit)를 사용하여 희석된 시료를 Q 컬럼에 로딩한다.
11. QA 버퍼 및 QB 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glycerol)와 함께 Q 컬럼을 HPLC 장비에 장착한다. 유량을 1 mL/min으로 설정한다.
12. "pump wash" 프로그램을 실행하여 QB 버퍼에 이어 QA 버퍼(각 1-2 CV)로 장비를 세척한다. 시스템 유량을 3 mL/min으로 설정한다.
13. UV1은 280 nm로, UV2는 260 nm로 설정한다. 96 딥웰 플레이트를 사용하여 분획을 수집한다.
14. 0% QB부터 시작하여 매회 5%씩 농도를 높여 각 농도당 3-4 CV를 적용하는 용출제(QB 버퍼)의 단계적 구배(stepwise gradient)를 사용하여 단백질을 용출한다. N0P 단백질 복합체는 15% QB 버퍼에서 용출된다.
15. 모든 단백질이 용출되면 100% QB 버퍼 (2 CV)로 컬럼을 세척한다.
16. Superdex 200 Increase 10/300 GL 겔 여과 컬럼(직경 x 길이: 1.0 cm x 30 cm)으로 단백질을 분리하고, 버퍼 E (20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid 또는 HEPES pH 7.4 및 200 mM NaCl)로 평형화한다.
17. 단백질이 포함된 분획을 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분석한다.

3. 바이러스 특이적 NC의 인비트로(in vitro) 조립

참고: RSV 특이적 NC (N:RNA)의 인비트로(in vitro) 조립은 준비된 N0P 복합체를 RNA 올리고뉴클레오타이드와 함께 배양하여 수행되었습니다. 그 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 조립된 복합체를 N0P 및 과량의 RNA로부터 분리하였습니다(그림 2).

1. 정제된 N0P 복합체와 RNA oligo를 1:1.5의 몰비로 혼합하여 실온에서 1시간 동안 배양한다. 일반적으로 다음 단계를 위해 1 mg/mL 농도의 N0P 단백질 1 mL면 충분하다. 동일한 양의 N0P 단백질만 포함하는 대조군 샘플을 준비한다.
2. 젤 여과 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼을 버퍼 E(20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl)로 사전 평형화한다.
3. 샘플을 21,130 x g에서 15분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 SEC 컬럼에 로딩한다.
4. N:RNA 조립 샘플과 N0P 대조군 샘플의 SEC 크로마토그래피 이미지를 비교하고, A260/A280 비율을 결합하여 어떤 피크가 조립된 N-RNA, N0P, 그리고 유리 RNA인지 식별한다.
5. 피크 분획을 수집하여 SDS-PAGE 겔을 전기영동하거나 그리드를 제작한다.
6. 조립된 N-RNA 복합체의 경우, N-RNA 피크의 모든 분획을 수집하여 RNA 추출을 수행하고 Urea-PAGE 겔을 전기영동함으로써 첫 번째 단계에서 혼합 및 배양한 것과 동일한 특정 RNA의 길이를 재확인한다.

결과

그림 1. 플라스미드 구조의 모식도. A. RSV N1-391의 구조; B. RSV P1-126의 구조; C. N1-391과 P1-126의 공동 발현을 위한 바이시스트로닉(bi-cistronic) 구조. 첫 번째 유전자인 RSV N1-391, 두 번째 유전자인 RSV P1-126, 항생제 내성 유전자(AmpR) 및 프로모터가 각각 노란색, 청록색, 분홍색 및 주황색 상자로 강조 표시되어 있다. 요약하면, RSV N1-391과 RSV P1-126의 유전자 삽입물이 각각 구축된 후 조립되었다.

그림 2. 단백질 복합체 N1-391P1-126의 정제 흐름도. E. coli 세포 배양의 접종 및 대량 배양과 원심분리를 통한 세포 회수 과정을 나타낸다. 세포 용해 후, 단백질 시료는 친화성 크로마토그래피(즉, Co2+ 컬럼), 이온 교환 크로마토그래피(즉, Q 컬럼) 및 겔 여과 크기 배제(SEC) 크로마토그래피를 통해 정제된다. 정제된 단백질 시료는 SDS-PAGE 겔을 통해 추가로 분석된다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose	SIgma	A9539-500G	LIC 방법을 이용한 컨스트럭트 제작
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	세포 배양용 항생제
AseI	NEB	R0526S	LIC 방법을 이용한 컨스트럭트 제작
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	His-tag 단백질 정제용
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	시료 가열
dCTP	Invitrogen	10217016	LIC 방법을 이용한 컨스트럭트 제작
dGTP	Invitrogen	10218014	LIC 방법을 이용한 컨스트럭트 제작
Glycerol	Sigma	G5516-4L	용액 제조
HEPES	Sigma	H3375-100G	용액 제조
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	단백질 정제
Imidazole	Sigma	I5513-100G	용액 제조
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	단백질 발현 유도
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	PCR용
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	세포 용해용 소니케이터
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	세포 배양용 쉐이커
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	용액 제조
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	DNA 정제
SSPI-HF	NEB	R3132S	LIC 방법을 이용한 컨스트럭트 제작
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	단백질 정제
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	LIC 방법을 이용한 컨스트럭트 제작
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	원심분리기, 최고 속도 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	용액 제조