투과전자현미경을 이용한 E형 간염 바이러스 나노입자의 시각화

초록

투과전자현미경(TEM)을 이용한 E형 간염 바이러스 나노입자(HEVNP) 관찰 TEM 이미징을 위해 HEVNP 샘플을 10 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pH 6.2로 0.5 - 2 mg/mL 농도로 준비하거나 희석합니다. 40 mA 글로우 방전(glow discharge)을 30초 동안 실시하여 탄소 코팅 그리드를 이온화함으로써 친수성 탄소 표면을 형성합니다. 글로우 방전 장비는 재료 표에 설명되어 있습니다. 참고: 그리드의 친수성 탄소 표면은 글로우 방전 처리 후 30분 동안만 유지됩니다. 핀셋으로 잡고 그리드에 2 µL의 HEVNP 샘플을 첨가한 후 15 - 30초 동안 기다렸다가 여과지로 흡수시킵니다. 즉시 그리드를 ddH20으로 세척하고 여과지로 흡수시킵니다. 즉시 그리드에 2% uranyl acetate 2 µL를 첨가하고 15초 동안 기다린 후 여과지로 흡수시킵니다. 샘플 그리드를 전자 제습 건조기에 넣고 하룻밤 동안 건조합니다. 그리드를 TEM으로 옮겨 10-80k 배율로 이미징합니다. HEVNP는 바이러스 RNA가 없기 때문에 TEM 상에서 직경 약 27 nm의 빈 정이십면체 단백질로 나타납니다. Chen, C. C., 외. 화학적 결합법을 이용한 E형 간염 바이러스 나노입자의 표면 기능화 J. Vis. Exp. (2018)

이 비디오에서는 투과 전자 현미경(TEM) 관찰을 위한 E형 간염 바이러스 유사 나노입자의 준비 및 음성 염색 방법을 보여줍니다. 이 방법은 자가 조립된 캡시드 단독 입자의 구조적 무결성을 강조하며, 고해상도 이미징을 통해 입자의 균일성과 순도를 확인합니다.

프로토콜

1. 투과전자현미경(TEM)을 이용한 E형 간염 바이러스 나노입자(HEVNPs) 관찰
   1. TEM 이미징을 위해 HEVNP 샘플을 10 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pH 6.2로 0.5 - 2 mg/mL 농도로 준비하거나 희석합니다.
   2. 친수성 탄소 표면을 생성하기 위해 탄소 코팅 그리드를 40 mA 글로우 방전(glow discharge)으로 30 s 동안 이온화합니다. 글로우 방전 장비는 재료 표에 기술되어 있습니다.
      참고: 그리드의 친수성 탄소 표면은 글로우 방전 처리 후 30 min 동안만 유지됩니다.
   3. 핀셋으로 잡고 그리드에 2 µL의 HEVNP 샘플을 추가한 후 15 - 30 s 동안 기다렸다가 여과지로 닦아냅니다.
   4. 즉시 ddH₂0로 그리드를 세척하고 여과지로 닦아냅니다.
   5. 즉시 그리드에 2 µL의 2% uranyl acetate를 추가하고 15 s 동안 기다린 다음 여과지로 닦아냅니다. 샘플 그리드를 전자 제습 건조기에 넣고 하룻밤 동안 건조합니다.
   6. 그리드를 TEM으로 옮겨 10-80k 배율로 이미징합니다. HEVNPs는 바이러스 RNA가 없기 때문에 TEM 상에서 직경이 ~27 nm인 빈 정이십면체 단백질로 나타납니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		글로우 방전 장치