지카 바이러스 게놈 복제 분석 12-웰 플레이트를 사용하여 웰당 1 x 10^5개의 미처리 Vero 세포를 2 ml 부피로 분주한다. 다음 날, 무혈청 배지를 사용하여 낮은 역가와 높은 역가의 바이러스 접종액(감염 다중도(MOI) 0.01 및 0.1; 웰당 400 µl)을 3반복으로 준비한다. 모의 감염의 경우, 무혈청 배지(웰당 400 µl)만 사용한다. 접종된 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 4-6시간 동안 배양한다. 매 1시간마다 플레이트를 옆으로 살살 기울여 접종액을 넓게 퍼뜨린다. 배양이 끝나면 접종액을 혈청 보충 배지(웰당 2 ml)로 교체한다. 48시간 및 96시간 시점에서 면역세포화학(ICC) 분석용 샘플을 수집한다. 메탄올 고정 세포를 사용하여 ICC를 수행한다. 고정된 세포를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고, ICC 블로킹 버퍼(PBS 내 3% 염소 혈청, 3% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1% Triton-x 100)로 블로킹한다. 마우스 단클론 항-dsRNA 항체 J2(1 µg/ml)를 블로킹 버퍼에 1:100으로 희석하여 처리하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다. 세포를 1x PBS로 세척하고, 2차 항체인 goat anti-mouse IgG-594(1 µg/ml)를 블로킹 버퍼에 1:1,000으로 희석하여 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 1x PBS로 세척하고 Hoechst 염색약을 사용하여 핵을 염색한 후, 형광 현미경의 100배 배율로 세포를 관찰한다(그림 1). Contreras, D., 외 등지카 바이러스 감염 세포 배양 시스템 및 인터페론의 인비트로(In Vitro) 예방 효과. J. Vis. Exp. (2016)
본 영상은 면역세포화학염색법(immunocytochemistry)을 사용하여 감염된 상피세포 내의 지카 바이러스 dsRNA 중간체를 검출하는 과정을 보여줍니다. 감염된 세포를 고정시킨 후 블로킹 용액으로 블로킹합니다. 이어서 1차 및 2차 항체를 첨가합니다. 핵은 형광 염료로 염색합니다. 이후 형광 현미경을 통해 표지된 바이러스 dsRNA를 관찰합니다.
