바이러스의 농축 및 정제: ddH2O에 40% polyethylene glycol 6000과 1.5 M NaCl을 첨가하여 5x polyethylene glycol 6000 용액을 제조한다. 해당 용액을 액체 사이클에서 121 °C로 45분간 오토클레이브한다. 냉각 시 용액을 천천히 섞어준다. 참고: 용액은 처음에 탁하게 보이다가 냉각되면서 투명해진다. 불용성 물질을 침전시키기 위해 바이러스 상층액 수집액이 들어있는 50 ml 원추형 튜브를 2,000 x g에서 10분간 원심분리한다. 0.45 µm 저단백 결합 시린지 필터(PES 또는 PVDF)로 여과하여 바이러스 배지를 정제한다. 배지에 5x polyethylene glycol 6000 용액을 첨가한다 (최종 농도는 8% polyethylene glycol 6000 및 0.3 M NaCl이 되어야 한다). 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어준다 (볼텍싱 금지). 바이러스가 포함된 polyethylene glycol 용액을 4 °C에서 12시간 이상 배양하며, 가끔씩 다시 섞어준다. (9일 차) 바이러스가 포함된 polyethylene glycol 용액을 2,500 x g에서 45분간 원심분리한다. 상층액을 제거하여 버리고 다시 2분간 원심분리한다. 다시 상층액을 제거하여 버린다. 멸균 인산염 완충 식염수 320 µl(320 µl는 수집된 바이러스 포함 배지 원래 부피의 1/100에 해당함)를 첨가하여 펠렛을 재현탁하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다. 선택적으로, 로커 위에서 실온으로 30분간 펠렛을 재현탁한다. 펠렛을 재현탁한 후, 바이러스를 분주하고(0.5 ml 튜브당 5-10 µl), 분주된 액체를 -80 °C에서 냉동 보관한다 (동결-해동 반복 또는 4 °C 보관 시 타이터가 급격히 감소한다). 표준 프로토콜을 사용하여 바이러스 타이터를 측정한다. 즉, HEK293T 세포가 도말된 6-웰 플레이트에서 희석 계열을 수행하고 48시간 후에 형광 콜로니 수를 수동으로 측정한다. Fricano-Kugler, C. J., 외. 정위 고정 주입을 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 패키징 및 전달. J. Vis. Exp. (2016).
이 영상은 숙주 세포 잔해를 포함한 혼합 현탁액으로부터 렌티바이러스 입자를 농축하고 정제하는 단계별 과정을 보여줍니다. 이 절차는 원심 분리, 여과 및 PEG-염 침전법을 이용하여 수용성 불순물을 제거하는 동시에 바이러스 입자를 분리합니다. 최종 생성물은 버퍼에 재현탁하여 초저온에서 보관함으로써 바이러스의 감염력과 구조적 무결성을 유지합니다.
